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流行性感冒简称流感,是由流感病毒（Ⅳ）引起的一种急性呼吸系统疾病[1]。流感爆发主要是由A型流感病毒亚型引起的,部分亚型已在人群中传播。而流感大流行是由人-禽流感病毒重组病毒引起,其中A型H1N1、H3N2和B型流感病毒感染人偏多,每年呈季节性流行,常伴随咳嗽、高烧、流鼻涕、食欲减退以及全身肌肉酸痛等症状。目前,禽流感病毒H5N1和H7N9已突破种间屏障,具备人畜共患特征,具有引发大流行的可能[2]。流感病毒易发生抗原漂移或抗原转变,导致流感病毒多亚型共存,不同亚型间交叉保护性不好。目前的流感疫苗不能对抗原变异的流感毒株提供有效的保护,故研制一种可以同时预防多种亚型的流感病毒的疫苗迫在眉睫。本研究主要利用铁蛋白纳米粒子自组装和可修饰的特性,将流感病毒保守抗原HA2和M2e插入到铁蛋白纳米粒子的N端,通过原核表达系统和昆虫-杆状病毒表达系统表达基于铁蛋白的多表位流感纳米粒。佐剂 Alum、MF59、CpG、Poly:IC、MF59+CpG、MF59+Poly:IC 分别与多表位流感纳米粒混合后,制成疫苗并免疫小鼠。通过免疫的效果,筛选出适用于多表位流感纳米疫苗的佐剂。通过攻毒实验评价了各组疫苗的保护效果,为通用型流感纳米疫苗成功研发奠定基础。1.基于铁蛋白的多表位流感纳米疫苗的原核表达及鉴定将H1/H3/B亚型流感病毒HA2和M2e保守抗原基因串联Ferritin基因,形成HA2-M2e-Ferritin 基因（简称 HM2e-Ferritin）。将 HM2e-Ferritin 氨基酸序列按照大肠杆菌常用密码子进行优化并合成,同时单独扩增出Ferritin基因,将它们克隆至原核表达载体pET-32a。通过双酶切和测序鉴定重组质粒,将阳性质粒转入感受态细胞BL21（DE3）,再经过IPTG诱导表达。通过对诱导条件、诱导温度和诱导剂浓度的优化,获得最佳的蛋白表达条件。重组蛋白经镍柱纯化后,通过SDS-PAGE鉴定,结果显示HM2e-Ferritin蛋白和Ferritin蛋白以可溶性形式存在于蛋白上清。WB鉴定表明,HM2e-Ferritin和Ferritin蛋白具有免疫反应性,HM2e-Ferritin蛋白分别具有HM2e和Ferritin的活性;利用电子透射显微镜和纳米粒度仪对重组蛋白分析,这两种蛋白均能形成纳米粒结构,Ferritin蛋白组装的颗粒大小在12～20nm,HM2e-Ferritin蛋白组装的颗粒大小在20～70nm,呈狭窄尺寸分布的纳米笼结构。结果表明,本研究通过大肠杆菌表达系统获得了具有纳米粒结构的HM2e-Ferritin蛋白,该蛋白具有生物学活性,为新型纳米疫苗的研制以及疾病诊治提供了理论基础。2.基于铁蛋白的多表位流感纳米疫苗的杆状病毒表达及鉴定参照A/Jilin/JYT-01/2018（H1N1）毒株的全基因组序列,将其HA2基因和HM2e-Ferritin基因按照密码子偏好优化合成。利用酶切连接的方法将HA2基因和HM2e-Ferritin基因分别插入pFastBacDual双载体,构建重组穿梭质粒pFBD-HA2-HM2e-Ferritin。通过重组穿梭质粒转化、蓝白斑筛选杆粒、重组杆粒转染Sf9细胞等步骤,成功拯救出重组杆状病毒。通过酶切、PCR、WB以及IFA等方法鉴定检测,结果表明成功拯救出重组杆状病毒,命名为rBV-HA2-HM2e-Ferritin。重组杆状病毒感染悬浮Sf9细胞,收取细胞悬液,通过超离、蔗糖密度梯度离心获得重组蛋白。利用电子显微镜对重组蛋白进行分析,TEM下可见约20 nm的病毒样颗粒。结果表明,通过杆状病毒系统获得包装双组分的多表位流感纳米粒,为广谱流感病毒疫苗的研发提供了新思路。3.多表位流感纳米疫苗佐剂的筛选及免疫效果评价以原核表达纯化的HM2e-Ferritin蛋白为抗原,分别与佐剂MF59、CpG、Poly:IC、Alum、MF59+CpG和MF59+Poly:IC佐剂按一定比例混合制成疫苗。将制备的疫苗分别免疫5周龄雌性C57BL/6小鼠,每次剂量为50μg/只,每隔3周免疫一次,共免疫三次,并设置阴阳性对照组、单纯抗原对照组（HM2e-Ferritin蛋白）和佐剂对照组。对于体液免疫应答,每周眼眶采取各组小鼠血,分离血清,进行IgG抗体分型和特异性IgG水平检测。结果表明,各疫苗组（含HM2e-Ferritin组）均可诱导较强的血清抗体IgG、IgG1和IgG2a应答,与对照组差异显著（P<0.001）。抗体效价结果显示,Alum和MF59+CpG疫苗组,能够显著提高特异性抗体的产生,抗体效价最高大于1:8×105,与对照组相比,统计学差异极显著（P<0.01）。对于细胞免疫应答,随机处死三免一周的小鼠,取脾脏分离淋巴细胞,进行流式分析和淋巴细胞增殖实验。结果显示,HM2e-Ferritin蛋白能够诱导T淋巴细胞免疫反应。细胞因子测定结果显示,Alum、CpG和MF59+CpG疫苗组诱导的IL-4和IFNγ反应,与PBS组相比,统计学差异显著（P<0.01）。攻毒后小鼠肺部病理变化、体重变化和存活率三项指标表明,MF59+CpG疫苗组和Poly:IC疫苗组小鼠肺部基本正常;各组体重均有下降,PBS组体重下降最快,且恢复较慢。在第7到9天时,疫苗组小鼠体重陆续恢复;MF59和MF59+CpG疫苗组小鼠存活率可达100%。综上所述,多表位流感纳米疫苗激发小鼠产生强烈的细胞免疫和体液免疫,能够有效抵抗H1N1流感病毒的感染。