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研究背景甘丙肽(Galanin,Gal)是一种具有生物活性的脑-肠肽(Brain-gut peptide,BGP),属于神经肽类的一种,由29-30个氨基酸组成,因其分子结构中N-末端和C一末端分别由甘氨酸(Glycine,Gly)和丙氨酸(Alanine,Ala)残基组成,故此得名甘丙肽。研究人员首次从猪小肠中将Gal提取出来,Gal广泛分布于人和哺乳动物的胃肠道等外周神经系统(Peripheral nervous system,PNS)、中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)和内分泌系统(The endocrine system,TES)中,在下丘脑(Hypothalamus,POAH)、海马(Hippocampus)、杏仁核(Amygdala)、基底前脑皮层以及脊髓背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)等区域均检测到Gal及其受体的表达。Gal通过三种亚型受体甘丙肽受体1(GalR1),甘丙肽受体2(GalR2),甘丙肽受体3(GalR3)介导,进而发挥多种生理功能,包括认知、记忆和情绪调节、摄食、癫痫发作等,其中Gal/GalR2与抑郁症最为相关。研究发现Gal参与了抑郁症的发生以及发展过程,并在这一过程中起着非常重要的作用。GalR2是一种G蛋白偶联受体,主要在下丘脑、海马杏仁核、皮质部分区域和背根神经节等部位集中分布。研究人员发现刺激大鼠GalR2的表达后,可以起到抗抑郁的作用,另外对GalR2基因敲除鼠进行观察,发现更容易表现出抑郁样行为。综上所述,Gal与GalR2可能是治疗抑郁潜在药物作用的靶点。下丘脑是维持机体能量代谢生理活动的重要中枢,参与学习记忆、奖赏、情绪、饮食调节等行为。逍遥散为疏肝解郁经典名方,同时又为治疗抑郁症的常用中药制剂,Gal/GalR2在下丘脑分布广泛,因此逍遥是否通过调节Gal/GalR2而对抑郁症起到缓解和治疗作用有待进一步研究。研究目的本课题通过慢性温和不可预知应激(CUMS)法复制大鼠抑郁症模型,并且从宏观表现和实验指标等方面对动物模型进行评价,并通过生物学检测方法对CUMS抑郁症模型大鼠下丘脑内Gal及其受体GalR2进行检测,观察抑郁症大鼠下丘脑Gal及其受体GalR2在蛋白和基因水平的变化情况,并观察逍遥散是否对其具有调节作用,研究逍遥散在治疗抑郁方面的作用与机制。1研究方法采用6周CUMS法复制抑郁症大鼠模型,将40只SPF级雄性健康SD大鼠于北京中医药大学SPF级动物房中适应性饲养7天,每笼5只,并给予常规饲料及去离子水,实验室温度控制在22士2℃,湿度保持在30%-40%,光照维持正常昼夜节律。根据体重情况对所有大鼠进行随机分为四个组:正常组、模型组、逍遥散组和氟西汀组。采用CUMS法建立抑郁症大鼠模型,造模期间通过对大鼠的外在表现、摄食量变化、体重变化、糖水偏好程度、旷场实验等进行观察并对动物模型进行评价。造模成功后,将大鼠下丘脑取出,用蛋白质印迹法(WesternBlot,WB)检测其受体GalR2的表达情况,采用酶联免疫吸附测定法(Enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)检测GaL的表达情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Reversetranscription-duantitatve polymerise chain reaction,RT-qPCR)检测Gal及其受体GalR2基因的表达。研究结果(1)经过6周CUMS造模之后,模型大鼠出现毛发干枯发黄、喜静少动、便质偏稀、摄食量减少和体重增长缓慢等症状。旷场实验中模型大鼠总穿格数、修饰次数以及站立次数与其他组大鼠比较明显减少,而逍遥散组和氟西汀组大鼠经灌服相应的药物治疗后其相关表现有所改善。(2)RT-qPCR实验结果表明模型大鼠下丘脑Gal表达上升,与模型组相比较,逍遥散组和氟西汀组大鼠Gal表达量无明显差异。模型组大鼠GalR2表达下降,逍遥散组和氟西汀组大鼠其表达量与模型大鼠相比GalR2的表达都有不同程度的升高,具有明显差异。表明逍遥散对GalR2有上调作用。(3)ELISA实验结果表明模型大鼠下丘脑Gal含量升高,逍遥散组和氟西汀组大鼠Gal含量相较模型组差异不明显,蛋白表达情况与基因表达情况略有不同。(4)WesternBlot结果显示模型组大鼠下丘脑GalR2蛋白表达量下降,逍遥散组和氟西汀组大鼠其表达量与模型大鼠相比都有不同程度的升高,同样表明逍遥散对GalR2有上调作用。蛋白表达情况与基因表达情况基本一致。结论(1)经过6周CUMS法成功复制了抑郁症大鼠模型。(2)大鼠下丘脑中Gal/GalR2含量在各组中出现了不同差异,提示抑郁症模型存在Gal/GalR2功能性改变。(3)逍遥散和氟西汀对GalR2基因和蛋白水平表达起到了不同程度的上调作用,促进Gal与GalR2结合而发挥效应,这可能是逍遥散调节抑郁症的生物学基础之一,而GalR2可能是其作用的主要靶点。