P27基因多态性及其蛋白表达与子宫内膜异位症的关系

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研究背景:子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)是一种激素依赖性、出血性、遗传性疾病,累及育龄期妇女的10%-15%。临床上主要表现为痛经、不孕、慢性盆腔痛、性交痛等,严重影响患者的生活质量。EMs虽然是一种良性疾病,但它表现的种植生长和远处转移特性,使之成为难治之症。尽管近年来研究日渐深入,但其确切的发病机制至今仍未明确。目前关于EMs发病机制的学说主要有:内膜经血逆流种植学说(Simpson学说)、体腔上皮化生学说、播散学说及免疫学说等,其中以内膜经血逆流种植学说为主导理论。但该理论解释不了80-90%的妇女有经血逆流,而只有10-15%形成EMs这一现象。近年,由我国学者郎景和教授总负责的课题组,对在位内膜在EMs发病中的作用进行了系统的研究,并据此提出了关于EMs发病的分子机制假说“在位内膜决定论”:EMs发病与否取决于患者在位内膜的特性,经血逆流只是实现这一由潜能到发病的桥梁,即人与人之间基因所致的内膜的差异导致了患病率的不同这是对Simpson学说的重大修正,也与1997年Kennedy提出的“内异症可能是由多位点基因和环境因素相互作用导致的一种遗传性疾病”的观点具有一致性。因此,近年来越来越多的研究开始关注基因多态性与EMs遗传易感性之间的相关性。P27是近年来发现的抑癌基因,其编码的蛋白是一种广泛存在的细胞周期素依赖激酶抑制因子(CDKI),它主要通过阻断细胞周期中G1/S期的转换,实现对细胞周期的负性调节。近来研究发现P27基因突变或多态性及其蛋白表达可能与多种人类肿瘤的发生发展及预后有关。本研究首先通过检测EMs患者和非EMs妇女P27蛋白表达水平在体外培养的在位子宫内膜细胞及内膜组织中的差异,初步明确P27蛋白与EMs发病的关系。在此基础上,进一步采用PCR-RFLP的方法,检测并分析EMs患者和非EMs妇女中P27基因多态性的分布,以探讨P27基因的多态性与中国汉族妇女EMs发病遗传易感性的关系。方法:1.体外培养EMs在位内膜细胞及正常在位内膜细胞,并对其进行鉴定,采用流式细胞术对其P27蛋白的表达进行定量分析。同时采用免疫组化法检测EMs患者38例异位内膜、38例在位内膜和22例非EMs患者正常对照子宫内膜组织中P27蛋白的表达水平。流式结果分析:流式细胞术定量分析以对数方式采集数据,以实验样品蛋白表达的平均荧光强度(均道值)表示各组蛋白的表达含量。采用独立样本t检验分析两组间的差异。免疫组化结果采用SAS8.0统计学软件进行数据处理。应用χ2检验、Fisher精确检验法及Spearman等级相关来分析P27蛋白的表达。P<0.05为差异有统计学意义。2.采用聚合酶链反应-限制性片段长度(polymerase chain reaction restrication fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法,分析101例EMs患者和110例非EMs患者的P27基因第109密码子多态性位点的基因型。计算各等位基因的表型频率,分析是否符合Hard-Weinberg遗传平衡定律。应用SPSS 16.0软件对P27基因型及等位基因型在研究组和对照组中的分布进行行×列表的χ2检验。应用非条件Logistic回归模型计算表示相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及95%可信区间(confidential interval,CI)。P<0.05为有统计学意义。结果:1.体外培养EMs在位内膜细胞及正常在位内膜细胞均取得成功。光镜下观察均可见间质细胞和腺上皮细胞,但形态和大小在两组之间未见明显差异。流式细胞术测定P27蛋白在体外培养的EMs在位内膜细胞中的表达低于正常在位内膜细胞,具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果发现P27蛋白的表达多定位于腺上皮细胞的细胞核。EMs在位内膜及非EMs正常在位子宫内膜P27蛋白的表达具有周期性变化,分泌期明显高于增生期(P<0.05)。P27蛋白在EMs病例组异位和在位内膜的阳性表达率无显著差异(P>0.05),但二者均明显低于对照组水平(P<0.05)。2.P27Ⅴ109 G基因型和等位基因型的表达在EMs组和非EMs对照组之间有差异(P<0.05)。携带G等位基因的基因型(VG+GG)可提高Ⅲ、Ⅳ期EMs发病的风险(P<0.05)。结论:1.P27蛋白在EMs患者在位和异位内膜的表达降低,提示P27蛋白及其参与的细胞周期改变可能与子宫内膜异位症的发生发展有密切关系。2.P27基因第109密码子多态性可能是中国河北育龄期妇女患Ⅲ、Ⅳ期EMs的危险因素
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