核桃黑斑病是由核桃黄单胞杆菌(Xanthomonas arbicola pv.juglandis)引起的细菌性病害,是世界各大核桃种植区最主要的叶部和果部病害。发病时可以侵染核桃的各个器官,包括雄花、雌花、果、嫩枝、芽和叶,影响树势生长发育,且严重导致核桃产量及品质的下降。目前,核桃黑斑病主要采用含铜类农药进行防御和控制,但易导致病菌耐药性的增加及环境的污染。提高核桃品种的抗病性是解决这一问题最经济、最有效的方法,而抗病育种的前提是对不同核桃品种的抗病性进行良好评估,此外,对核桃响应黑斑病病菌侵染的机制的研究对抗病育种具有指导意义。由于当前核桃抗病材料及其遗传信息的匮乏,有关核桃与核桃黄单胞杆菌互作机制的研究,尤其是关于病原菌致病力的研究以及植物抗病机理的研究较少,抗病品种的培育进展缓慢。本研究利用田间调查及人工接种(离体叶片接种和植株叶片接种)的方法,对18个核桃不同品种(无性系)的黑斑病抗性进行了评价。此外,通过选取10个不同黑斑病抗性的品种(无性系),分析其在黑斑病病原菌侵染过程中各生理生化指标的响应规律。最后,利用转录组测序技术,分析黑斑病易感品种和抗病无性系健康叶片及发病叶片中基因的表达水平的变化,分析抗病相关基因间的差异,筛选主要的抗病相关基因,以期揭示核桃黑斑病抗病机理,为核桃黑斑病抗病育种提供一定的指导和理论依据。研究结果如下:1、通过田间调查评价,确定了18个核桃品种(无性系)的黑斑病抗性强弱分别为:JS 91(JS 92、JS 86、清香、JS 71、JS 64)>JS 199(JS 200、硕星)>攀核一号(盐源早)>川早一号(川早二号、辽核、JS 100)>蜀江一号(JS 65、香玲)。采用离体叶片接种和植株叶片接种的方法进行人工评价,评价结果与田间调查结果比较发现,人工接种评价结果与田间调查结果均显著相关(P≤0.05),其中,植株叶片接种评价的结果与田间调查结果相关性最大(r=0.789),即植株叶片接种评价比离体叶片接种评价更接近田间调查评价。因此,植株叶片接种评价可以作为田间调查评价的补充,为核桃黑斑病抗性材料的筛选提供依据。2、选取10个黑斑病抗病性不同的核桃品种(无性系),采用植株叶片接种方法,分别观察其在接种核桃黄单胞杆菌0 d、3 d、7 d、14 d、28 d后叶氧化还原相关酶活性、酚类化合物含量及酚类合成相关酶活性以及膜脂过氧化的变化情况。结果表明,超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量在侵染后活性显著升高,但其变化大小与品种(无性系)抗病性大小无关;过氧化氢酶侵染后活性变化无明显规律;过氧化物酶活性、总酚类物质含量、多酚氧化酶与苯丙氨酸转化酶活性在侵染后均显著升高,且在早期的变化均与抗病性强弱显著正相关(P≤0.05)。总酚类含量以及酚类相关酶活性在接种后被诱导且其变化与抗病性强弱呈正相关关系,说明酚类物质代谢在核桃黑斑病的早期防御中发挥重要作用。3、以核桃黑斑病抗病无性系JS 91和感病品种香玲的健康及发病叶片为材料进行转录组测序,通过基因注释、代谢通路注释以及健康及发病叶片中差异基因表达的变化,构建了核桃响应黑斑病病原菌侵染的转录组表达谱,分析核桃对黑斑病病原菌的响应以及抗病相关基因在此响应上的差异。本研究对8个核桃样本进行转录组测序,共获得77325条注释的Unigene,该注释结果为核桃其他相关研究的基因注释提供了重要的参考。通过抗病相关基因的差异表达分析,获得以下结果:第一,在病原体识别方面,抗病无性系通过FLS2和XA21识别病原体建立了病原体触发的免疫(PTI)以抵御病原体的攻击;而感病品种中抑制FLS2以及XA21的相关基因(RING/U-box和E3泛素连接酶;环指泛素连接酶、质膜ATP酶以及蛋白磷酸酶2C)被诱导,该防御途径受到抑制。第二,在细胞壁重建方面,抗病和感病品种(无性系)同时通过抑制木葡聚糖水解酶相关基因以抑制细胞壁水解,抗病无性系诱导果胶酯酶、转录因子MYB、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶类酶、愈伤组织合成酶和大量转录因子bHLH及壁相关激酶参与细胞壁重建,从而阻碍病原菌的继续扩散;感病品种诱导促进细胞壁降解的木葡聚糖内切葡聚糖酶以及纤维素酶,且MYB转录因子被诱导而bHLH没有显著变化,同时感病基因MLO被特异性诱导,其细胞壁重建受阻,组成型防御被病原体克服。第三,在ROS清除方面,抗病无性系过氧化物酶相关基因被诱导,感病品种超氧化物歧化酶相关基因被诱导,其余活性氧清除酶(谷胱甘肽转移酶、过氧化氢酶等)相关基因则被抑制或没有显著变化。此外,感病品种中多酚氧化酶被诱导而苯丙氨酸转移酶被抑制,其苯丙烷类途径受到抑制。第四,在信号传导方面,抗病无性系中大量钙离子相关基因被诱导,其主要通过钙离子信号传导途径传递抗病防御信号;而与乙烯信号传导相关基因则仅在感病品种中被诱导或抑制,其主要通过乙烯信号传导途径传递抗病防御信号,抗病信号传导途径上的差异可能与品种(无性系)抗病性差异有关。本研究对18个核桃品种(无性系)进行了黑斑病抗性评价,并明确了植株接种评价方法可以作为田间调查评价方法的补充。生理生化指标的测定发现,总酚含量以及与酚类相关的过氧化物酶、多酚氧化酶及苯丙氨酸转化酶活性在病原菌侵染后被诱导,且其变化与核桃黑斑病抗性大小有关,可以作为检测抗病性的候选参考指标。此外,转录组测序结果有助于理解核桃黑斑病抗病防御,抗病无性系与感病品种在抗病相关途径上的差异有助于揭示其抗性差异的原因,得到的相关基因为后续的核桃黑斑病抗病机理研究以及抗病育种提供了一定的理论依据。