【摘 要】
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油菜菌核病是甘蓝型油菜中由核盘菌引起的常发性真菌病害。目前,对甘蓝型油菜菌核病的防治手段主要是农业防治和物理防治。核盘菌与植物的互作过程中会分泌草酸盐,使植物组织酸化,叶绿体类囊体腔p H降低,增加紫黄质脱环氧化酶（Violaxanthin de-epoxidase,VDE）活性,降低紫黄质含量,促使ABA积累减少,导致植物气孔开放、胼胝质和ROS减少,增加植物对核盘菌的敏感性。本研究基于BnaV
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油菜菌核病是甘蓝型油菜中由核盘菌引起的常发性真菌病害。目前,对甘蓝型油菜菌核病的防治手段主要是农业防治和物理防治。核盘菌与植物的互作过程中会分泌草酸盐,使植物组织酸化,叶绿体类囊体腔p H降低,增加紫黄质脱环氧化酶（Violaxanthin de-epoxidase,VDE）活性,降低紫黄质含量,促使ABA积累减少,导致植物气孔开放、胼胝质和ROS减少,增加植物对核盘菌的敏感性。本研究基于BnaVDE的结构特征,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BnaVDE基因进行敲除,创制BnaVDE突变株,探索BnaVDE在甘蓝型油菜与核盘菌互作机制中的功能。主要结果如下:1)BnaVDE具有VDEs家族的三个保守结构域。BnaVDE具有Bna A06.VDE和Bna C05.VDE氨基酸同源序列,将Bna A06.VDE和Bna C05.VDE与拟南芥、水稻、烟草的VDE进行生物信息学分析,发现Bna A06.VDE和Bna C05.VDE均具有VDEs家族的三个保守结构域:N-末端富半胱氨酸结构域、脂质转运蛋白结构域和C-末端富谷氨酸结构域;且VDE氨基酸序列的同源性在60%以上,说明VDE氨基酸序列在进化发育过程中比较保守。2)BnaVDE基因在油菜各组织中均有表达。对甘蓝型油菜各组织（根、茎、子叶、茎叶、莲座叶、花、花蕾和角果）中的Bna A06.VDE和Bna C05.VDE进行表达水平分析,结果表明Bna A06.VDE和Bna C05.VDE在甘蓝型油菜的各个组织中都有表达且存在差异,在叶片中表达水平最高。3)甘蓝型油菜BnaVDE突变株的获得。将CRISPR/Cas9体系通过农杆菌介导的遗传转化对BnaVDE进行突变。获得37株Bna A06.VDE转基因植株,阳性率为63.79%;31株Bna C05.VDE转基因植株,阳性率为83.78%和3株Bna A06C05.VDE转基因植株,阳性率为10.71%。其中,获得13株Bna A06.VDE纯合突变株,突变率为35.14%;5株Bna C05.VDE杂合突变株及9株Bna C05.VDE纯合突变株,突变率为45.16%。对T0代突变株A1、A46、C20、C25和C34进行q PCR分析,发现在A1和A46突变株中,Bna A06.VDE的表达量下调;在C20、C25和C34植株中,Bna C05.VDE的表达水平均显著下调。4)BnaVDE参与甘蓝型油菜对核盘菌的抗性。对甘蓝型油菜WT植株叶片接种核盘菌及q PCR分析,发现Bna A06.VDE和Bna C05.VDE表达水平均显著下调;对C20和WT接种核盘菌的结果显示,C20和WT的病斑面积在12 h时无显著差异;在24 h、36 h和48 h时,C20的病斑面积显著小于WT。综上,BnaVDE具有VDEs家族的三个保守结构域,且BnaVDE参与甘蓝型油菜对核盘菌的抗性。本研究通过CRISPR/Cas9技术创制BnaVDE突变株,为后续探索BnaVDE在甘蓝型油菜抵御核盘菌侵染过程中的功能提供实验材料及理论依据。
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