甘露糖受体(Mannose Receptor，MR)又称CD206，是MR家族成员之一，属C-型凝集素受体，最早发现于大鼠肝枯否细胞，后发现广泛存在于动物体内的多种细胞，主要生物学功能表现在介导内吞清除内外源的多糖，多肽，蛋白，核酸和杀灭病原体，转运和递呈抗原启动免疫应答，是保守的模式识别受体(Pattern Recognition Receptor，PRR)之一。 据报道，表达在淋巴管内皮细胞上的MR是L-选凝蛋白的天然配体，两者的相互作用介导了淋巴细胞的归巢。本实验室的前期工作表明小鼠肝癌细胞高低淋巴道转移株HCa-F和HCa-P的淋巴道转移潜能与其表达的L-选凝蛋白正相关，此外，发现淋巴瘤细胞p388D1的淋巴道转移潜能也与其表达的L-选凝蛋白相关。故认为MR与L-选凝蛋白存在的相互作用可能介导肿瘤的淋巴道转移，转移机制与淋巴细胞的“归巢”相似。 实验目的： 利用DNA重组技术将甘露糖受体MR的C-型凝集素样糖识别结构域4-7(CT-LD4-7)与分泌性信号肽Sig和人IgG的Fc段构成嵌合基因，插入到真核表达载体pCDNA3.1中，瞬转293T细胞，检测蛋白表达，为以后利用Protein-A亲和层析纯化蛋白，进行黏附实验来验证甘露糖受体MR与L-选凝蛋白相互作用，以及究其相互作用与肿瘤淋巴道转移的相关性提供基础。 实验方法： 1．酶切鉴定本实验室已有的连接有MR CTLD1-8序列的T载体，记为pMD-18T/CTLD1-8，并以之为模板自行设计引物进行PCR扩增MRCTLD4-7序列(1701 bp)，通过TA亚克隆将CTLD4-7基因插入pMD-18T载体中构建载体pMD-18T/CTLD4-7，转化细菌扩增质粒，酶切鉴定并测序。 将pMD-18T/CTLD4-7的CTLD4-7基因酶切并切胶回收，插入表达载体pX(pX载体的酶切位点上游连有IgG的分泌性信号肽，下游连有人IgG的Fc段)中，扩增并酶切鉴定后命名为pX/CTLD4-7。 单酶切pX/CTLD4-7和表达载体pCDNA3.1，回收pX/CTLD4-7的酶切产物片段Sig-CTLD4-7-Fc(2451bp)和pCDNA3.1片段，连接两者，构建的表达载体记作pCDNA3.1/Sig-CTLD 4-7-Fc，酶切鉴定，并用PCR的方法确定连入片段的方向，之后进行测序鉴定。 2．培养293T细胞，脂质体法将去内毒素的pCDNA3.1/Sig-CTLD4-7-Fc表达载体小量瞬转293T细胞，同时作阴性对照和阳性对照，分别在24h，48h，72h时收集培养上清，ELISA检测分泌蛋白的表达量，同时作细胞免疫化学进行表达的定性分析。 结论： 1．重组的pcDNA3.1/Sig-CTLD4-7-Fc表达载体构建成功。 2．通过脂质体法转染真核细胞293T，可在细胞中成功表达。