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研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE),作为一种常见金属洗涤剂、脂类萃取剂、涂料稀释剂广泛应用于电子、电镀、制药等行业。TCE可以引起职业接触人群发生职业性三氯乙烯药疹样皮炎(Occupational Dermatitis Medicamentosa-like of Trichloroethylene,ODMLT)。ODMLT可出现多系统、多脏器的损伤,其中部分患者可出现严重的肾脏损伤,严重威胁相关职业人群健康状况。对于ODMLT发病机制,目前研究发现除了迟发型IV型变态反应以外,补体系统在发病过程中可能也起到了重要的作用。在前期的动物实验研究中发现肾脏损伤中存在着补体系统的激活,补体C3a在致敏小鼠肾脏组织中有明显的沉积现象。C3a可与其特异性受体C3aR相结合,发挥扩张血管、趋化炎症细胞、调节炎症反应等功能。国内外研究发现C3a-C3aR系统在多种肾脏损伤中起到了十分重要作用,故深入研究补体系统在TCE致敏小鼠肾脏损伤中的作用对探讨ODMLT发病机制有着十分积极的意义。研究目的本研究通过检测小鼠肾脏中C3及C3aR的表达,使用C3aR特异性拮抗剂C3aRA(SB290157),来检测其对TCE致敏小鼠肾脏损伤的影响,揭示补体系统在TCE致敏小鼠免疫性肾损伤中的作用,进一步为探索职业性三氯乙烯药疹样皮炎(ODMLT)肾脏损伤机制提供依据。研究方法选取42只无特定病原体(SPF)级,雌性6-8周BALB/c小鼠,体重范围17.1-24.7(20.3±1.7)g。在适应性喂养一周后,根据随机分配原则将实验动物随机分为:空白对照组(5只)、溶剂对照组(5只)、TCE处理组(16只)和TCE+C3aRA联合处理组(16只)。参照BALB/c小鼠三氯乙烯致敏模型方法,在末次激发24h后,根据小鼠皮肤反应状况,按照皮肤致敏试验评分标准进行分组,当小鼠积分≥1分时,认为皮肤致敏阳性即分为致敏组,否则即判定为非致敏组,以此将处理组区分为致敏组和非致敏组。予末次激发后第3天,眼球采血及无菌取出肾脏组织,使用肾脏组织制备石蜡切片和冰冻切片。采用肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)检测试剂盒,检测血清中肾功能相关指标CRE、BUN的水平;肾脏HE染色来观察肾脏病理变化状况;免疫组化检测肾脏组织中相关炎症因子的表达水平;实时荧光定量RT-PCR检测肾脏组织中C3、C3aR及炎症因子的逆转录水平;免疫荧光检测肾脏组织中足细胞蛋白Podocin的表达;Western Blotting检测肾脏组织中C3aR、Podocin蛋白的表达。研究结果(1)致敏情况:试验期间小鼠生长正常,各组间小鼠体重改变无明显差异。空白对照组和溶剂对照组小鼠皮肤未见明显变化,根据皮肤反应情况,TCE处理组致敏率7/16(43.75%),TCE+C3aRA处理组致敏率6/16(37.5%)。(2)肾脏病理结果显示:在空白对照组、溶剂对照组和所有非致敏组小鼠肾脏中未发现明显的病理改变。TCE致敏组肾脏中可见明显的炎性细胞浸润,肾小管结构改变,肾小管上皮细胞溶解现象。在C3aRA处理后致敏小鼠肾脏炎性细胞浸润明显减少、肾小管损伤减轻,肾脏损伤得到明显改善。(3)肾功能检测结果:溶剂对照组与各非致敏组之间CRE、BUN水平均未发现明显差异,TCE致敏组和TCE+C3aRA致敏组CRE、BUN均高于溶剂对照组和相应的非致敏组。但是,发现在C3aRA处理后,TCE+C3aRA致敏组CRE、BUN水平均明显低于TCE致敏组。(4)肾脏组织中C3aR测定结果:与空白对照组和溶剂对照组相比,TCE非致敏组C3aR在转录水平上均未见明显变化。与溶剂对照组和相应未致敏组比较,TCE致敏组小鼠肾脏组织中C3aR在转录水平上显著上升。Western Blotting结果也显示,空白对照组和溶剂对照组以及TCE非致敏组中C3aR蛋白的表达量较低,但是在TCE致敏组中C3aR蛋白的表达明显上升。(5)肾脏组织中C3测定结果:与空白对照组和溶剂对照组相比,TCE非致敏组在C3转录水平上未见明显变化,TCE致敏组肾脏组织中C3在转录水平上显著上升。(6)肾脏组织中细胞因子IL-1β、TNF-α测定结果:空白对照组和溶剂对照组与各非致敏组之间肾脏组织中IL-1β、TNF-α转录水平均未发现明显变化,TCE致敏组和TCE+C3aRA致敏组肾脏组织中IL-1β、TNF-α均高于溶剂对照组和相应非致敏组。但是发现在C3aRA处理后,TCE+C3aRA致敏组肾脏组织中IL-1β、TNF-α转录水平明显低于TCE致敏组。免疫组化也呈现相同的结果,在空白对照组和溶剂对照组中均未发现有IL-1β、TNF-α的明显表达,而在TCE致敏组和TCE+C3aRA致敏组肾脏组织中有明显的表达,且TCE+C3aRA致敏组IL-1β、TNF-α较的表达水平有所下降。(7)肾脏组织中足细胞Podocin蛋白测定结果:在空白对照组和溶剂对照组中Podocin蛋白可见正常表达,与空白对照组和溶剂对照组相比TCE致敏组和TCE+C3aRA致敏组小鼠肾脏Podocin蛋白的表达明显降低,但是与TCE致敏组相比,TCE+C3aRA致敏组Podocin蛋白表达水平有明显回升。Western Blotting结果也显示,与TCE致敏组相比,TCE+C3aRA致敏组与Podocin蛋白表达水平有明显回升。结论(1)TCE致敏小鼠肾脏中补体C3和C3aR表达明显上调,TCE致敏小鼠肾脏损伤中存在局部补体激活的现象。(2)补体C3aR信号通过上调炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌,加重了TCE致敏小鼠免疫性肾脏损伤(3)TCE致敏小鼠免疫性肾损伤中Podocin蛋白的表达下调。(4)补体C3aR信号可能影响了TCE致敏小鼠肾脏中Podocin蛋白表达。