HBV是一种嗜肝DNA病毒，部分双链环状，大约由3200个碱基对组成，含有四个部分重叠的开放读框，编码外膜蛋白[前-S1，前S2和HBV表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）]、核壳蛋白[HBV核心抗原（hepatitis B virus core antigen，HBcAg），e抗原（hepatitis B virus e antigen，HBeAg）]、转式激活蛋白（X）和多聚酶蛋白（P）。宿主感染HBV可能有几种不同的临床过程和结果，包括急性自限性肝炎、暴发性肝炎、慢性活动性肝炎（CAH）、肝硬化、急性加重的肝衰竭和无症状健康携带者（AsC）。HBV非直接致细胞病变，HBV感染者肝损伤是由于免疫应答介导的。细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）在机体抵抗各类病毒感染和／或导致免疫病理损伤中起着极为重要的作用，HBV C基因编码183-185个氨基酸的核壳蛋白，含有抗原特异性CTL识别表位，当HBcAg多肽表达在肝细胞膜表面时，诱导的细胞免疫应答对于杀伤病毒感染的肝细胞起到至关重要的作用。HBV是高度变异的，野生病毒在复制过程中为适应环境改变，常可发生基因差异或基因变异，形成毒株群体的异质性。HBcAg的第48-60、84-101和147-155位氨基酸序列是CTL识别的表位，常出现聚集变异，常见的是AA60的亮氨酸被缬氨酸替代（L60V）、AA87的丝氨酸被甘氨酸替代（S87G）和AA97的异亮氨酸被亮氨酸替代（I97L）。病毒变异甚至抗原表位上单个氨基酸的替代就能抑制其与HLA的结合、或者减弱T细胞受体（TCR）对抗原肽的识别，进而影响CTL应答。变异热点聚集于某一区段，提示该区段可能会发生相应功能的改变，产生与野生型不同的生物学效应。如果要研究HBV特异性CTL活性，必须在体外用HLA相容的转染体稳定刺激增殖HBV特异性的CTL，建立稳定的CTL刺激细胞和靶细胞系统。急、慢性HBV感染者病人的外周血中HBV特异性CTL前体数量太低，不能直接被检测到；而且HBV不能在体外直接感染，产生表达HBV基因产物的刺激细胞和靶细胞受HLA抗原限制，必须通过高效率的基因转染方法获得。因此，我们用定点突变的方法将携带1.2拷贝的HBV（adr亚型）全基因组的p3.8Ⅱ质粒C基因区进行突变，插入EBO-plpp真核细胞表达载体，转染慢性HBV感染者EBV永生化的B淋巴母细胞系，经潮霉素筛选后能稳定表达，用于分析慢性HBV感染C基因变异对CTL应答的影响，以了解慢性HBV感染过程中病毒清除和肝细胞损伤中的作用机制。第一部分慢性乙型肝炎感染者EBV转化的B淋巴母细胞系建立Epstein Barr病毒（EBV）是一种广泛存在的人类疱疹病毒，在体外能够高效率感染外周血中静止的B淋巴细胞，使其永生化成为有增殖能力的B淋巴母细胞系（LCLs），将HBV特异性抗原编码的重组质粒转染到LCLs中稳定表达，由于能够分裂增殖、易传代和长期培养，为体外进行免疫学和遗传学研究提供了良好的细胞来源。1．PBMC采集和Epstein Barr病毒的制备血清学确诊的慢性HBV感染者46例（CAH31例，AsC15例），无菌采集外周静脉血30ml，肝素抗凝，等体积PBS稀释混匀；淋巴细胞分离液lymphoprep^TM密度梯度分离，收集中间层乳白色混悬液为外周血单个核细胞（PBMC）层，细胞计数后备用。将产生EBV的B95-8细胞密度调整为1×10⁶个／ml，用10 ml的完全RPMI-1640培养基（10％胎牛血清），移入培养瓶中，37℃，5％CO₂培养箱中培养，培养期间不需更换和补充培养液，12～14d后离心收集细胞，反复冻融，使细胞裂解后收集培养上清，此时上清中可含有高滴度的EB病毒，液氮中储存备用。2．建立永生化的B淋巴母细胞系用1ml EBV上清感染1×10⁶个PBMC，加入含有2μg／ml CyA，2.5μg／ml CpG的完全RPMI-1640培养液，定期按1：1体积半换液，3～4周后即可获得无限生长的细胞系LCLs，永生化的LCLs细胞形态呈母细胞样改变，体积增大，胞质丰富，呈球状，增殖的细胞集落，悬浮或贴壁生长。利用流式细胞术检测LCLs细胞表面标志CD19和CD23。表达CD19和CD23分子阳性细胞分别为94±2.7和90.2±4.7（％，X±SD n=42）。CD19是所有B细胞共有的表面标志，B细胞活化后亦不消失；CD23主要存在于激活的B细胞表面，是B细胞活化的标志，可根据B细胞表面CD23表达与否来判断B细胞能否在体外长期培养。46例PBMC中，42例LCLs转化成功，成功率为91.3％。冻存和复苏后增殖活性、细胞形态和生物学特性未改变。第二部分乙型肝炎病毒全基因组C区突变株在B淋巴母细胞系中稳定表达在慢性HBV感染中，C基因的变异大部分多数集中在AA48-60、AA84-101和AA147-155的3个小段序列的聚集变异，比其它部位有较高的替代率。我国的慢性乙型肝炎病人常在这些区段出现变异。在这些聚集变异中，更常见的是常见的是AA60的亮氨酸被缬氨酸替代（L60V）、AA87的丝氨酸被甘氨酸替代（S87G）和AA97的异亮氨酸被亮氨酸替代（I97L），HBcAg在关键位置上个别核苷酸的点突变造成的错义变异，可影响病毒的复制和病毒蛋白的表达，产生与野生型不同的生物学效应。本文采用定点突变和基因重组技术构建含1.2拷贝的HBV（adr亚型）全基因组L60V、S87G、I97L突变质粒真核表达载体，转染病人自体永生化的LCLs，并稳定表达，为研究HBV C基因热点变异的生物学意义提供实验基础。1．HBVp3.8Ⅱ突变株及EBO-HBV重组质粒真核细胞表达载体构建用QuikChang^TM定点突变试剂盒对携带1.2拷贝HBV全基因组（adr亚型）p3.8Ⅱ质粒C基因区进行突变，用于定点突变的引物：L60V：第60位亮氨酸CTG被缬氨酸GTG替代P1V60 5’-CACTCAGGAAAGCTATTGTGTGTTGGGGT-3’（nt2061-2089）P2V60 5’-ACCCCAACACACAATAGCTTTCCTGAGTG-3’（nt2089-2061）S87G：第87位的丝氨酸GCT被甘氨酸GGT替代P1G87 5’-GAATTAGTAGTCAGGTATGTCAATGTTAAT-3’（nt2147-2176）P2G87 5’-ATTAACATTGACATACCTGACTACTAATTC-3’（nt2176-2147）I97L：第97位由异亮氨酸密码子ATC被亮氨酸密码子CTC替代P1L97 5’-GGGCCTAAAACTCAGACAACTATTGT-3’（nt2178-2203）P2L97 5’-ACAATAGTTGTCTGAGTTTTAGGCCC-3’（nt2203-2178）以p3.8Ⅱ双链DNA质粒为模板，pfu Turbo高保真DNA聚合酶直接对突变引物进行PCR扩增，得到带缺口的环状双链DNA，产物用限制性内切酶DpnⅠ消化甲基化和半甲基化的模板DNA，剩下含突变位点的子代DNA，突变产物转化到E coli XL1-Blue感受态细胞中，修补带缺口的环状DNA链并扩增，用Amp抗性LB平板筛选阳性克隆，并经PCR反应和双酶切反应鉴定正确后，进行序列测定，以验证预期突变位点的存在，突变后的质粒记为p3.8Ⅱ-V60、p3.8Ⅱ-G87、p3.8Ⅱ-L97，原模板p3.8Ⅱ质粒记做p3.8Ⅱ-WT。经测序证实的突变质粒以SacⅠ和KpnⅠ双酶切后凝胶回收，插入EBO-plpp真核细胞表达载体，得到EBO-HBV WT、EBO-HBV V60、EBO-HBVG87和EBO-HBVL97，分别转化细菌E coli JM109，挑取阳性克隆，经测序证实目的基因存在后大量制备。EBO-HBV重组质粒的SacⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳后均可见两条区带，分别与1.2拷贝HBV基因组和EBO载体的大小相符。2．EBO-HBV重组质粒转染永生化B淋巴母细胞系（LCLs）采用脂质体介导转染的方法，用2ml无抗生素的培养液重悬1×10⁷LCLs接种六孔板；将4种待转染的质粒DNAWT、V60、G87、L97各10μg分别用500μl无血清培养基稀释，轻柔混匀；用500μl无血清培养基稀释20μl Lipofectamine^TM2000，轻柔混匀，室温孵育5min；将500μl DNA稀释液与500μl Lipofectamine^TM2000稀释液混合室温放置20 min，此时溶液中会出现絮状物；然后在已接种细胞的6孔板中每孔加入100μl DNA-Lipofectamine混合液，轻柔摇动培养板使液体充分混匀；放置37℃，5％CO2培养箱中培养，4-6h后更换细胞培养液，24h后更换新鲜选择性培养液，以含200μg／ml潮霉素的完全RPMI-1640筛选，每隔三天1：1更换培养液，潮霉素筛选两周以上，得稳定表达的阳性细胞株。EBO重组质粒在LCLs细胞中的抗原表达：质粒转染并稳定筛选两周后，收集细胞培养上清用Abbott公司微粒子免疫荧光法（microparticle enzyme-immunoassay, MEIA）AxSYM^TM检测HBsAg和HBeAg表达，WT，V60，G87，L97转染细胞培养上清都能检测到HBsAg和HBeAg表达。筛选阳性克隆细胞Western blot检测能够得到21kd的HBcAg的表达，证明得到转染后稳定表达HBV野生株和变异株的LCLs。第三部分乙型肝炎病毒核心区热点变异与CTL应答的体外研究一系列的研究表明，肝细胞的损伤是由于HBV介导的免疫应答引起的，HLA-Ⅰ类分子限制的CTL应答是清除HBV感染的决定因素。本研究用EBO-HBV全基因组C基因突变株质粒，转染自体永生化LCLs，作为分析CTL细胞毒性的刺激细胞和靶细胞，体外诱导病人PBMC中的CTL，分析9例CAH病人和5例AsC病人在相同的HLA背景下，HBV野生株和变异株特异性的CTL应答作用。1．建立HBV特异性CTL刺激细胞和靶细胞HLA-A2阳性CAH9例，AsC5例。无菌采集肝素抗凝的外周静脉全血30ml，lymphoprep^TM淋巴细胞分离液密度梯度离心，获得PBMC；经EBV转化建立永生化的LCLs，以EBO-HBV WT，EBO-HBVG87和EBO-HBV L97脂质体介导法转染LCLs，潮霉素筛选得到稳定表达目的基因的阳性细胞作为刺激细胞和靶细胞。未转化的PBMC作为效应细胞。2．HBV特异性CTL体外诱导lymphoprep^TM密度梯度法分离PBMC，5×10⁵个细胞／ml用含10％人AB型血清的RPMI-1640重悬，接种于96孔细胞培养板中，用⁶⁰Co（3000rad）照射过的含三种不同EBO-HBV重组体（WT，G87，L97）LCLs（1×10⁵细胞）刺激，每4天补充rlL-2（20U／ml），⁶⁰Co（3000rad）的刺激细胞，2W和4W以后分别进行细胞毒活性分析。3．细胞毒活性分析（CTL分析）乳酸脱氢酶法检测细胞毒活性每个样品分别设立实验孔和自发释放孔，将效应细胞与靶细胞以50：1的比例各50μl混合于96孔培养板中，250g离心4min，37℃，5％CO₂孵育4小时，靶细胞最大释放孔提前45分钟加入10μl（10×）细胞溶解液，继续孵育；250g离心4min，每孔吸出50μl上清，再加入50μl混合底物，室温孵育30 min，最后加50μl终止液，490nm波长酶标仪检测吸光值。靶细胞破坏百分率的计算：细胞毒活性（％）=（实验孔A值-效应细胞自发释放孔A值-靶细胞自发释放孔A值）／（靶细胞最大释放孔A值-靶细胞自发释放孔A值）×100％。4．结果实验显示9例HBeAg阴性的慢性活动性肝炎病人的细胞毒性T细胞可溶解表达HBV核心抗原野生株和突变株的自体细胞。HBV C基因区变异仍能引起CTL应答。以EBO-HBV-WT、EBO-HBV-G87、EBO-HBV-L97和EBO-plpp转染的LCLs作为靶细胞，以病人新鲜分离的自体PBMC作为效应细胞，E：T为50：1时分别检测抗原特异性CTL细胞毒性，虽然未经特异抗原刺激的PBL，仍有1例对转染了EBO-HBV WT的LCLs产生CTL应答，1例对转染了EBO-HBV G87的LCLs产生CTL应答。延长刺激时间能够诱导CAH病人的CTL应答，经EBO-HBV野生株和变异株转染体刺激自体的PBL，两周后，有4例对转染了EBO-HBV WT的LCLs产生了CTL应答；有5例对转染了EBO-HBV G87的LCLs产生CTL应答；有4例对转染了EBO-HBV L97的LCLs产生CTL应答。继续刺激到四周时，有5例对转染了EBO-HBV WT的LCLs产生CTL应答；有6例对转染了EBO-HBV G87的LCLs产生CTL应答；有5例对转染了EBO-HBV L97的LCLs产生CTL应答。9例HBeAg阴性的慢性活动性肝炎病人的PBMC中，有8例对转染了HBV核心抗原野生株或突变株的自体LCLs产生了特异性CTL应答，而且CTL应答表现为时间持续效应。有1例对对转染了HBV核心抗原野生株或突变株的自体LCLs始终无应答。5例AsC的CTL与表达HBV核心抗原野生株和突变株的自体细胞作用，始终未引起特异性CTL反应。