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膳食营养对慢性非传染性疾病的影响已日益受到关注。目前在慢性非传染性疾病中,恶性肿瘤在我国人群中居死因第一位。肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,中国是肝癌高发国家,其死亡率在恶性肿瘤中居第二位,因此HCC已经成为我国当前社会的重大疾病负担之一。在HCC发展过程中,肿瘤微环境与肿瘤之间的相互作用直接影响肝癌的进程。在此过程中,细胞通过释放趋化因子如白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、转录激活因子-3(signal transducers and activators of transcription-3,STAT-3)及花生酸类物质等等,一起组成新的肿瘤炎性微环境,在肿瘤增殖、侵袭转移、粘附,血管生成等过程中发挥重要作用。咖啡酸(caffeicacid,CaA)是一常见的多酚类化合物,作为许多植物化学物的基本骨架,广泛存在于多种植物性食物如谷类、番茄、苹果等,中草药以及咖啡、绿茶等饮品中。研究表明:CaA有显著的抗氧化和抗炎功能;在抗肿瘤方面,CaA能抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡,进而阻滞肿瘤发生发展。然而关于CaA调控肿瘤的炎性微环境的影响目前仍鲜见报道。方法一、CaA处理人肝癌细胞株和鼠巨噬细胞株常规培养人肝癌HepG2和MHCC97H或鼠RAW264.7巨噬细胞株24 h后,再分别用0.0、20或40 μM CaA或联合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理8、16或24 h。观察细胞相关炎症介质和相关通路/分子的变化情况。二、CCK-8法检测细胞活力应用碧云天公司生产的CCK-8 kit,在细胞培养体系中加入10%体积浓度的CCK-8反应4 h后,在酶标仪上450 nm波长处读取吸光度值。三、细胞转染及荧光素酶报告基因实验将细胞常规培养24 h后,将微小RNA(microRNA,miRNA)激活/抑制剂、相关蛋白的高表达质粒或siRNA、荧光素酶报告基因质粒加入LipofectamineTM 2000试剂中轻柔混匀,室温下放置15-20 min后加入细胞培养液中12 h。四、实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)提取细胞总RNA并测定其浓度,逆转录成cDNA后,分别应用NF-κB、IL-6、STAT-3、TNFα、14-3-3ζ和 iNOS 引物通过 ABI-7300 定量 PCR 仪检测。五、甲基化实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)提取细胞总DNA并测定其浓度,经亚硫酸氢钠修饰后,分别应用甲基化和非甲基化引物通过ABI-7300定量PCR仪检测。六、Western blot提取细胞蛋白并测定浓度,SDS-PAGE分离蛋白后经半干法转膜,用特异性一抗4℃孵育过夜,进一步常温结合二抗1h后,用增强型化学发光法检测相关蛋白表达及磷酸化水平。七、免疫共沉淀提取细胞总蛋白,用IP抗体与蛋白混合过夜将靶蛋白沉淀后,用Western blot法检测蛋白-蛋白相互作用。八、酶联免疫吸附法(ELISA)将受检样本与固相抗体接触反应后加入酶标抗体。加底物定量以对照组的吸光度值定为100%,计算相对蛋白分泌水平。九、数据统计分析实验所得统计数据用均数±标准差表示,SPSS 13.0软件双侧t检验或单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)法分析组间统计学差异,设定p<0.05则认为有统计学显著性差异。结果一、CaA抑制人肝癌细胞株和鼠巨噬细胞株的炎症反应水平应用20 μM CaA处理人肝癌HepG2和MHCC97H细胞株,或应用40 μM CaA联合LPS处理RAW264.7细胞24 h后发现CaA可显著抑制两种不同类型细胞中IL-6、TNFα、iNOS、NO的表达和/或合成水平。二、CaA对NF-κB和STAT-3通路的影响在人肝癌HepG2和MHCC97H细胞株中,CaA可显著抑制NF-κB/RelA和STAT-3的表达和磷酸化水平;有趣的是:在RAW264.7细胞中,CaA仅可显著抑制NF-κB/RelA和STAT-3的磷酸化水平,而对二者的表达水平无明显影响。三、肝癌细胞中,CaA对NF-κB和STAT-3的调控机制在人肝癌HepG2和MHCC97H细胞株中,CaA可显著上调miR-124的表达水平,后者通过结合到RelA和STAT-3 mRNA的3’-UTR区,靶向抑制二者表达水平;进一步研究发现:CaA通过DNA去甲基化作用激活miR-124。四、巨噬细胞中,CaA对NF-κB和STAT-3的调控机制在鼠RAW264.7细胞中,CaA可抑制14-3-3ζ表达水平进而抑制LPS诱导的NF-κB和STAT-3磷酸化激活;进一步发现CaA通过抑制TNFα同时增加14-3-3ζ泛素化水平,最终通过转录和转录后调控的方式抑制14-3-3ζ。五、miR-124在CaA抑制肝癌细胞炎症反应中的作用通过anti-miR-124转染细胞后发现:敲除miR-124显著抑制CaA处理所致HepG2和MHCC97H细胞中IL-6的表达和分泌水平。六、14-3-3ζ在CaA抑制巨噬细胞炎症反应中的作用通过转染14-3-3ζ质粒后发现:高表达14-3-3ζ可显著逆转CaA对RAW264.7细胞中IL-6、TNFα、iNOS、NO的表达和/或合成水平。结论1.CaA可抑制人肝癌细胞株和鼠巨噬细胞株的炎症反应水平;2.NF-κB和STAT-3信号通路在CaA抑制人肝癌细胞株和鼠巨噬细胞株的炎症反应过程中发挥重要作用;3.DNA去甲基化激活miR-124在CaA抑制NF-κB和STAT-3信号通路,进而抑制肝癌细胞分泌IL-6过程中发挥重要作用;4.14-3-3ζ在CaA抑制NF-κB和STAT-3信号通路进而抑制巨噬细胞炎症反应过程中发挥重要作用。