微生物几丁质酶兼具抑制病原真菌生长和杀灭害虫的双重作用，它对动植物、人体无毒害、不污染生态环境。开展微生物几丁质酶及其在生物防治和分子生物学方面的应用研究，对于发展我国农业生产和加强环境保护将具有重要的意义。本研究利用几丁质和水稻纹枯病菌细胞壁富集的方法从水稻植株微生物区系中筛选出了3株对多种植物病虫害均具较强抗性的高产几丁质酶菌株。经过安全性初步检测、分类鉴定、几丁质酶对各种病原菌的作用机理探讨后，进行了水稻纹枯病、稻瘟病、水稻白叶枯病以及稻苞虫的田间抗病虫试验。为了提高几丁质酶活性、抑菌活性以及对水稻的促生作用，进而提高抗病虫生防效果，我们首次在生物防治研究中利用混合培养的方法，取得了显著的成效。但是直接利用菌体进行生物防治很容易受到环境的影响而导致防治效果不稳定，从分子生物学和基因工程角度可以更加有效地利用几丁质酶，于是我们进行了几丁质酶产生菌相关功能蛋白的分离纯化、几了质酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达的前期研究工作，以期为抗病虫生防工程菌株构建和培育抗病虫转基因工程植株奠定基础。研究结果摘要如下： 1．筛选模型探索和建立。将水稻植株根茎叶、根际土壤及埋入土壤中的几丁质和水稻纹枯病菌菌核经水稻纹枯病菌细胞壁培养基富集后，共分离得到166株几丁质酶产生菌。从埋入土壤的几丁质和水稻纹枯病菌菌核及其上种植的水稻植株的分离率(91.1％)大大多于其它来源菌株(仅8.9％)。从中选出24株具有较高几丁质酶活性的菌株进行拮抗纹枯病菌实验，有3株表现出较强的抑菌能力，即：C2—1，C2—6和T3—1，经测定，其几丁质酶活性分别为：25.5U/ml，18.0U/ml和7.5U/ml。其中C2—1对水稻纹枯病菌菌丝还具有较强的降解作用。 2．抑菌谱及几丁质酶产生菌安全性初步检测。C2—1，C2—6与T3—1对其它病原真菌，如M.griesa、、Fusarium moniliforme、Sclerotinia sclerotiorum、Alternaria sp．、Fusarium geaminearum、Botrytis sp．、Aelminthosporium sp．、Aspergillus niger、Aspergillus flarus、Penicillium sp.、Aureobasidium sp．、Colletorichum sp．和病原细菌Xanthomons oryzae pv oryzae等具有较强抑制作用。其中，C2—1对水稻稻苞虫还具有较强的触杀作用，12h和24h后，室内杀虫效果分别达57.77％、89.88％。经喂养小白鼠进行安全性初步检测，结果未发现有中毒现象，剖杀小白鼠内脏也无异常现象，初步表明它们对人畜是安全的。 3．几丁质酶菌拮抗机理探讨。当C2-1加入上述病原真菌的液体培养基中时，观察发现病原真菌菌丝发生了扭曲、变形、断裂、菌丝细胞壁肿胀裂解、细胞质聚集、原生质体外溢或裸露等异常现象。拮抗后菌丝再培养，菌丝停止了生长或几乎不能生长，表明病原真菌菌丝在几丁质酶产生菌的作用下受到了严重破坏。 j．几丁质酶产生菌鉴定。经形态和生理生化鉴定，oil 为圆抱芽抱杆菌（Icjvjus globjsporus），CZ－6为多粘类芽抱杆菌（Paenbacjllus尸o1＊1nalcrs）． 目前国内外尚未发现 其具有较强几丁质酶话性并在作物抗病虫方面有所应用，且国内尚无该菌的相关报道，它 们均是新的几丁质酶产生菌和新的生防菌。芽抱杆菌和类芽抱杆菌是一类重要的酶制剂生 产菌，是几丁质酶的理想来源，表明在四川生态条件下存在着大量的新的抗病虫资源。 5．田间抗病虫生防试验。i间生防小区试验表明，CZ－1对水稻纹枯病、稻瘟病、水稻 白叶枯病的防效分别为：66．02％、71．73％、73．24％，它对稻苞虫的防效可达96．61％；CZ－6 叉水稻纹枯病、稻瘟病、水稻白卜枯病的防效分别为：37．99％、22．38％、74．77％；T3J二 水稻纹f，‘i）ds和水稻稻瘟病的防效分别为：33，93％，69．33％。CZ－1是一种具有潜在应用前景 的生防菌株。它们的成功筛选可能会填补我国微生物几丁质酶在生物防治中应用的空白。 6．混合培养提高生防效果研究。我们根据分离来源、生长速度、抑菌特性和几丁质酶 活力等，选出3株对水稻纹枯病菌有较强抑菌力的代表性菌株进行混合培养试验。结果表 明：混合培养处理CZdT3J抑菌活性明显比单菌处理CZ1、T3叫高，其差异达3倍以上； 混合培养处理 TZ－29＋CZ－l、TZ－29＋T3－l、TZ－29＋CZ－l＋T3刁明显地提高了生长速度和抑al 圈直径。混合培养单位含菌量也有所增加，同步桔抗试验表明，各菌间无相互抑制作用。 混合培养几丁质酶活力大多高于单菌培养，其中混合培养处理 CZ－l＋T3－l、TZ－29＋CZ－l＋T3－1 几丁质酶沃力在各组合中达极显著水平。水稻促生作用试验结果表明混合培养与单菌培养土 对地上部分促生效果差异不大，但对地下部分促生效果特别明显。其中混合培养处抑 TZ－29＋CZ－l、TZ－29＋T3－l、CZ－l＋T3－l 根系干重分别比清水对照增加 46．74％、56．79％、“36．33L＃i合培养菌体在水稻根表的定殖能力较单菌培养有所增强。水稻纹f．U蚓 间ljJ效