论文部分内容阅读
家蚕是一种鳞翅目模式昆虫，其免疫防御机制是研究热点。昆虫马氏管是一种自主免疫组织，能够完全不依赖于脂肪体而启动有效免疫应答。本课题组已在蛋白质水平上初步证实家蚕马氏管具有免疫调控功能。近年研究表明miRNA在生物体抗病毒感染方面发挥重要作用。本文对家蚕马氏管响应BmNPV病毒感染后在miRNA水平上进行探索研究，获得以下初步结果。一、家蚕马氏管组织小RNA文库的构建与深度测序家蚕五龄起蚕感染BmNPV-EGFP，注射TC-100为对照，在感染后3h、6h、12h和24h时相收集马氏管组织，构建了CK和NPV两个小RNA文库，通过Illumina Solexa高通量测序平台进行深度测序。CK文库和NPV文库中测得原始小RNA序列分别为16681601条和16509994条。经过生物信息学分析，CK文库和NPV文库中有效数据留存率较高（平均为76.5%），有效数据长度主要分布在22bp左右，为Dicer酶剪切合成miRNA主要长度分布范围，可供进一步数据分析。序列与Genbank数据库比对，去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的降解片段，合并处理后，两个样本共检测到已知miRNA313个（其中254个为共有）；DEGseq分析结果显示两者差异表达的miRNA为53个；根据家蚕基因组序列预测获得新miRNA108个。根据CK和NPV两个文库中miRNA测序拷贝数差异，共筛选出候选miRNA中28个，其中17个已知miRNA和11个新miRNA。二、家蚕马氏管响应BmNPV感染候选miRNA的实验验证通过茎环RT-PCR方法对上述28个候选miRNA进行了实验验证，经测序鉴定正确的有11个miRNA，其中4个已知miRNA （bmomiR375、bmomiR2731、bmomiR927、bmomiR7）和7个新miRNA （miRN11、miRN13、miRN33、miRN49、miRN74、 miRN80、miRN89）。采用RT-PCR方法对11个候选miRNA进行了家蚕马氏管对照组与病毒感染组混合样品中相对表达分析，结果显示，bmo-miR375在感染病毒组样品池中表达显著高于对照组，miRN49和miRN74在对照组样品池中表达显著高于病毒感染组，而其他miRNA在对照组和感染组中相对表达量无明显差异。我们从中筛选出候选bmo-miR375做进一步表达分析与靶标预测。三、家蚕编码的bmo-miR375的表达分析及其靶标预测家蚕五龄起蚕感染BmNPV-EGFP，注射TC-100为对照，在感染后3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h和120h时相收集马氏管组织，对bmo-miR375在不同时相表达进行半定量分析，结果显示bmo-miR375在对照组和病毒组中各时相均有表达。除了48h时相外，其他时相病毒感染组中bmo-miR375的相对表达均高于对照组中各时相。尤其是在12h、24h和96h这3个时相中，bmo-miR375在病毒感染组相对表达量显著高于对照组。在病毒感染后3h、6h和12h和24h之间，bmo-miR375的相对表达水平整体上呈逐渐上升趋势，然后在48h、72h呈现下降趋势，在96h、120h时，又呈先升高后下降趋势。bmo-miR375在病毒感染组中12h、24h和96h升高趋势原因，推测可能是家蚕通过编码自身bmo-miR375来调控BmNPV在马氏管内复制进程相关基因的表达，以便达到宿主抵抗病毒感染的免疫防御效应。而bmo-miR375在48h、72h和120h呈现的下调趋势，可能与BmNPV以自己的某种方式调控宿主miRNA的合成，从而抑制bmo-miR375的表达，来破坏由宿主miRNA介导的宿主防御系统相关。在48h时相中，bmo-miR375在对照组中相对表达水平较其他时相中略高，这是一个有趣的发现，该现象原因需要进一步实验验证。利用生物信息学软件PITA、RNAhybrid和RNA22，对bmo-miR375在家蚕和病毒基因组中靶标预测。bmo-miR375在家蚕宿主内的可能的靶标为表皮蛋白、超气门蛋白、家蚕myb转录因子和30K脂蛋白前体，而其在病毒BmNPV中可能靶标有病毒转录调控因子p47、杆状病毒Y142蛋白和几丁质结合域2型。其中p47为病毒转录调控因子，为RNA聚合酶亚基，参与病毒的复制过程，推测家蚕宿主马氏管组织可能通过编码的bmo-miR375来直接或间接抑制病毒复制过程，从而达到响应病毒感染的免疫效应。我们对bmo-miR375在表皮、中肠、脂肪体、后部丝腺、气管、精巢、血淋巴、马氏管等组织中的表达谱分析，结果显示，bmo-miR375在对照组中肠和血淋巴中无表达，而在其他组织均有表达，尤其是在后部丝腺中，bmo-miR375的相对表达水平显著高于其他组织。而该miRNA在病毒感染组的所有组织中均有表达，无论在对照组还是感染病毒组中，bmomiR375在家蚕后部丝腺组织中表达量都显著高于其他组织中的表达。相比于对照组中组织，bmo-miR375在病毒感染组后部丝腺内表达量更高，其次是马氏管组织。推测bmo-miR375可能在家蚕后部丝腺中具有其他生物学功能。上述研究结果为家蚕马氏管与病毒之间在miRNA水平上可能的免疫调控机制提供一些基础信息，至于miRNA是以何种机制参与免疫应答等，有待于进一步的实验阐明。