目的意义：血吸虫病(Schistosomiasis)人兽共患，危害严重。目前我国血吸虫病防治的难点是中间宿主钉螺难以消灭，重复感染严重，动物是血吸虫病的主要传染源，迫切需要加强血吸虫病免疫预防研究，建立更为特异、敏感的家畜血吸虫病诊断检测技术。曼氏血吸虫和日本血吸虫菲律宾株的研究结果表明血吸虫23KD抗原是很有发展潜力的候选疫苗抗原和诊断制剂。本研究针对在中国流行的日本血吸虫(中国大陆株)，开展23KD抗原基因的克隆、表达，评估重组23KD抗原在小鼠和绵羊体内诱导的免疫保护作用，探讨免疫保护机制和提高免疫保护效果的有效途径；并以重组23KD抗原作为诊断试剂，建立黄、水牛和绵羊血吸虫病诊断检测的新方法，为我国血吸虫病防治提供新思路和新技术。 方法及结果：应用PCR技术首先克隆到编码日本血吸虫(中国大陆株)23KD抗原大亲水区多肽的DNA片段(Large hydrophilic domain of the Sj23，LHD-Sj23)，在大肠杆菌系统中获得高效表达，免疫亲和层析获纯化产物，表达产量约占菌体总蛋白量的30-40％，融合蛋白分子量约为33.5KD。免疫分析表明该融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。应用该融合蛋白免疫鼠血清进一步免疫筛选血吸虫成虫c-DNA文库，首次获中国大陆株23KD抗原全长编码基因，其开放阅读框内含657个碱基。同源性分析表明该DNA片段的核苷酸序列与菲律宾株相关序列的同源性为99.85％(656/657)，氨基酸的同源性为100％；与曼氏血吸虫Sm23相比，核苷酸的同源性为80.37％(528/657)，氨基酸的同源性为83.94％(183/218)；与埃及血吸虫(Sh23)相比，核苷酸的同源性为80.21％(527/657)，氨基酸的同源性为81.9％(177/218)。结构分析显示Sj23抗原含4个转膜区和2个亲水区，属TM4SF膜蛋白大家族成员。将Sj23基因与表达载体pMalP重组表达，免疫印迹转移试验表明重组抗原(66KD)存在于大肠杆菌产物的沉淀部分。 用LHD-Sj23/pGEX重组抗原免疫两批小鼠，和空白对照组相比，分别获得57.8％(p＜0.01)和70.3％(p＜0.01)的减虫率，和pGEX载体表达蛋白免疫组相比，减虫率分别为52.6％(p＜0.05)和62～69％(p＜0.01)。进行了一批绵羊免疫试验，LHD-Sj23/pGEX免疫组相对空白对照组获得了66.1％(p＜0.0001)的减虫率，相对佐剂对照组获得了58.5％(p＜0.005)的减虫率和58.4(p＜0.005)的粪便虫卵减少率，表明该重组抗原可诱导较高的免疫保护作用，是一种值得深入研究的候选疫苗。 博【：学位论义 摘 要 中国农业科学院 免疫机理研究表明用 LHD－Sj23／pGEX免疫小鼠／绵羊后诱导了高水平的特异 性IgG抗体应答，特别以IgGZb抗体亚型的免疫应答最强。参照曼氏血吸虫23KD 抗原抗原表位的研究结果和日本血吸虫（中国大陆株）23KD抗原的氨基酸序列， 人工合成大亲水区多肽中一段含 T细胞和 B细胞表位的多肽 P14，与鸡血清白蛋 白pVA厂禹联后进行 了二批动物免疫试验，分别获得22．22％（p＜0＊5）干 3O．旧地p＜0刀1）的减虫率，明显高于OVA免疫对照组获得的减虫效果，说明该合 成多肽的氨基酸序列是日本血吸虫（中国大陆株）23KD抗原的重要抗原表位之 O 为寻找提高基因工程疫苗免疫保护效果的可能途径，本研究先后进行了多价 基因工程疫苗、重组抗原与低剂量的血吸虫病治疗药物毗睦酮或细胞因子IL－2联 合防治血吸虫病的探索。结果在多价疫苗研究中，以 LHD－Sj23／pGEX和另一个日 本血吸虫基因重组抗原 SjFABP脂肪酸结合蛋白）联合免疫大鼠，相对空白对照组 和佐齐对照组分另获得47二8Wp＜0刀1）和巧刀1Wp＜0刀1）的减虫率，而单独用 LHD－Sj23／pGEX基因重组抗原免疫大鼠时，相对空白对照组和佐剂对照组获得的 减虫率为 32．14％和 29二1％，用 SjFABP免疫大鼠，相对空白组获得的减虫率为 引．85％，说明用这两种基因重组抗原联合免疫时，提高了兔疫保护作用。在重组 抗原和毗喳酮联合防治绵羊血吸虫病试验中人HD－Sj23／pGEX免疫组获得了 22．忙％的减虫率（p＜0刀5），｛剂量毗喳酮处理组获得＊石％的减虫率（p＜0刀5），而 重组抗原和低剂量毗喳酮联合使用获得了5a刀9％的减虫率…＜0刀05X高于单独用 重组抗原兔疫或用毗喳酮处理组获得的减虫效果。此外重组抗原与重组的人IL2 联合免疫小鼠，或用质脂体包被后兔疫小鼠，未见增强免疫保护作用。 以重组抗原 LHD－Sj23巾GEX作为诊断抗原，应用 ELISA法检测黄、水牛和 绵羊血吸虫病，结果对黄、水牛的阳性符合率为 94．0009用4户 85．50O3历2）， 阴性符合率为 82．7o侣旧8）和 95．loo7侣），对绵羊的阳性符合率为 86．940（if门 X 阴性符合率为1000仔p卜与以血吸虫成虫抗原pWP