减数分裂是行有性生殖的生物在配子形成过程中都要经历的一种特殊的细胞分裂方式。近年来,脊椎动物减数分裂调控机制研究取得了重大进展,认为视黄酸(retinoic acid,RA)是哺乳类、鸟类及两栖类减数分裂起始所必须的,该机制涉RA信号通路多种因子的协同作用,但具体是哪种因子起到主导作用还有争议。小鼠中的研究表明,处于胚胎卵巢环境的生殖细胞受到来自中肾的RA调控则进入减数分裂,而处于胚胎精巢的生殖细胞由于CYP2681对RA的降解作用进入有丝分裂静息期。目前关于鱼类RA信号通路在生殖细胞减数分裂起始过程中的作用研究甚少。基于此,本研究以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)为研究对象,从RA合成、分解、通路及RA合成酶抑制剂citral和RA分别处理5 dah(dah,day after hatching)XX和XY幼鱼等方面进行硬骨鱼类减数分裂分子机制的研究。主要研究结果如下:　　 结合罗非鱼最新的全基因组测序数据对本实验室测序得到的罗非鱼雌雄性腺不同发育阶段的8个转录组序列分析,分离到RA信号通路多个重要因子,包括RA合成酶aldh1a家族(aldh1a1、aldh1a2和aldh1a3)、RA分解酶cyp26(cyp26a1、eyp26b1和cyp26c1)、RA受体rat(2个tara,1个rarb,2个rarg)、RA类受体rxr(1个rxra,2个rxrb,1个rxrg)以及RA结合蛋白erabp(crabp1a、crabp16、crabp2a和crabp2b)等,说明在罗非鱼性腺中存在较完整的RA信号通路。　　 RT-PCR和RACE相结合的方法从罗非鱼中成功克隆到cyp26b1和aldh1a2的基因序列,其全长cDNA分别为1926bp和1832bp。RT-PCR研究cyp26b1和aldh1a2在六月龄罗非鱼的组织表达模式,结果表明他们在多个组织广泛表达,aldh1a2在卵巢表达略高于精巢而cyp26b1在性腺表达无明显的性差。Real-timePCR研究其在罗非鱼性腺发育中的表达情况:在雌雄罗非鱼减数分裂开始之前(雌性10 dah到20 dah,雄性60 dah到70 dah),cyp26b1表达下调,aldh1a2表达上调,从而性腺此时积累RA,初步表明罗非鱼减数分裂起始需要RA。而雌雄减数分裂时间之所以不同,可能是在20 dab,aldh1a2在雌性表达水平高于在雄性,而cyp26b1在雌性表达低于在雄性,使得雌性性腺有较多RA,雌性在25 dab左右起始减数分裂,而雄性减数分裂被推迟到75 dab。　　 利用RA合成酶抑制剂citral(citral,1mM/kg饵料)拌食饲料投喂5 dash的雌性(XX)罗非鱼,连续处理70天后停药正常饲养。到1.5月龄(mah,month afterhatching),常规组织学观察,处理组是一个未分化的性腺结构,而对照组已发育成卵巢结构;4 mah时,处理组性腺呈现卵精巢状态,且绝大部分为精巢结构。这一结果表明罗非鱼卵巢减数分裂的起始需要内源RA的合成,也进一步证明RA在脊椎动物减数分裂中作用的相对保守性。　　 通过免疫组化检测雌激素合成酶Cyp19a1a在4 mah的citral处理性腺中表达情况,结果显示:相对正常卵巢,Cyp19a1a在处理组中表达明显降低,且只在保留有卵巢结构的部分表达,说明RA可能对性腺雌激素水平有调节作用。Real-timePCR检测aldh1a2和cyp26b1在芳香化酶抑制剂Fadrozole诱导3月龄雌性罗非鱼性逆转过程中表达变化,结果显示,从开始处理到45 dat,cyp26b1在处理组表达较高,aldh1a2在处理组有所降低,从而使得处理组RA降低。说明低水平RA可能与性腺朝着雄性逆转重启减数分裂相关,雌激素可能影响性腺中RA水平。　　 采用RA(RA,60μM/kg饵料,每隔一个月药物浓度加倍)拌食饲料投喂5 dab的雄性(XY)罗非鱼,连续处理70天后停药正常饲养。在2mah、3mah取材,常规组织学观察,处理组是一个未分化的性腺结构,且体细胞较少,而对照组已发育成精巢结构;5 mah时,处理组性腺是一个具有较大空腔的精巢。因此,可以看出给雄性(XY)罗非鱼外源添加RA推迟了性腺发育过程,并没有使减数分裂时间提前。RA处理到5mah后,部分用雌二醇接着处理40天,组织切片观察,此时性腺出现一个更大的空腔,生精过程紊乱。从以上结果推测,要使雄性罗非鱼的减数分裂时间提前并不容易控制,可能涉及更复杂的机制。　　 综上所述,本研究发现罗非鱼性腺中存在较完整的RA信号通路,性腺内RA水平的高低不是由单一合成酶或分解酶决定的,而是降解酶和合成酶(cyp26b1和aldh1a2)的协同作用;通过外源药物控制性腺内RA水平,从而控制减数分裂开始时间,就能影响性别分化方向,本研究结果初步表明RA对于雌雄罗非鱼减数分裂起始可能都是必要的;本研究还表明雌激素与RA信号之间可能存在相互作用,共同影响着鱼类性别分化方向。