雌三醇(E3)是一种内分泌干扰物质,即使在低浓度下也能发挥生物效应,它会干扰机体内分泌功能,引起内分泌失调,影响身体健康。近年来有报道不法商将雌激素应用于畜牧养殖,其危害已成为关注的焦点,国家也出台了相应的法律法规,禁止雌三醇等雌激素在畜牧生产中的使用,但在经济利益驱使下,滥用现象仍然时有发生。因此,加强对雌三醇等雌激素残留的监测和检测十分必要。免疫的方法具体灵敏度高、特异性高、成本较低、快速简便等特点,可以扩大食品的抽检的覆盖范围,对完善构建食品安全监测体系和保障人民的生命健康具有重要意义。本研究以雌三醇为对象,在前期研究的基础上进一步设计了新的免疫半抗原,制备多克隆抗体和单克隆抗体,同时建立ELISA及电化学传感器的方法,以期满足不同的检测需求。主要内容与结果如下:(1)半抗原合成与鉴定。针对原有雌三醇抗体灵敏度低的问题,结合雌三醇的结构特点,在酚羟基位置引入含有两个碳原子的末端为羧基的间隔臂,设计合成新的免疫半抗原E3-A(雌三醇-3-羧甲基醚),经质谱和核磁共振技术鉴定合成成功,将半抗原通过活泼脂法与载体蛋白偶联制备人工抗原,经紫外吸收光谱鉴定偶联成功。(2)多克隆抗体的制备及高灵敏icELSIA方法的建立。将新免疫原免疫新西兰大白兔,制备获得多克隆抗体,并建立ELISA分析方法。研究了不同包被原条件下ELISA方法的特异性,结果表明异源包被直接影响方法检测灵敏度以及抗体的特异性。在采用E2-A-OVA包被时,ELISA方法对E3的检测限(IC10)=0.017 ng/mL,IC50=0.185 ng/mL,线性范围为0.041~0.837 ng/mL,且对雌二醇没有交叉反应,特异性高。将该方法用于奶制品样品中雌三醇的检测,结果表明回收率在85.0%~106.5%之间,具有良好的准确性。与HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好(R2=0.973)。(3)单克隆抗体的制备及一步电沉积免疫传感器方法建立。为进一步保证抗体的良好来源,将免疫原免疫Balb/c小鼠,并取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合,制备获得一株稳定分泌E3单克隆抗体的细胞株E3-2C2,体内培养制备鼠单克隆抗体mAb-E3-A-BSA,效价为1:64000,1μg/mL E3抑制率为95.2%。基于单克隆抗体建立电化学免疫传感器方法。首先通过循环伏安法将普鲁士蓝-壳聚糖-纳米金(PB-CS-AuNPs)修饰在玻碳电极表面,以增加电极的比表面积、导电性和生物亲和性。通过纳米金固定包被抗原,蛋白封闭后加入一抗和药物,进行竞争免疫反应,加入二抗,形成包被抗原-一抗-二抗复合物,引起电极表面电化学性质的变化。据此构建了E3无标记电化学免疫传感器,对E3的检测限可达0.001 ng/mL,线性范围为0.001~100 ng/mL。实际样品雌三醇检出值达到1 ng/mL,回收率在92.5%~113.0%之间,与HPLC-MS/MS方法检测结果相关性良好(R2=0.993)。