精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase,EC 3.5.3.6)简称ADI,广泛存在于细菌、古细菌、厌氧真核生物中,是ADI途径精氨酸降解的第一个酶,在精氨酸缺陷型肿瘤、白血病治疗等方面具有广泛的应用前景,但目前用于临床试验的重组ADI主要来源于支原体,生物安全方面存在着一定的隐患,所以开发一种既具有高活性,又没有生物安全隐患的ADI具有非常重要的意义。本研究通过PCR技术获得了变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039)ADI基因序列,并对其进行了序列测定和分析。测序结果显示,基因开放阅读框为1254 bp,编码417个氨基酸,推测蛋白质大小为46.5 kDa。Blast分析显示它与恶臭假单胞菌(P. putida)和铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)同源性分别高达97 %和85 %。将获得的ADI基因片段克隆到pMD18-T载体上,酶切后与表达载体pET28a进行连接,构建了重组表达载体pET28a-ADI,并将其转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE与Western Blot分析证明重组ADI基因获得了表达,酶活测定证明其具有一定活性。通过初步诱导条件优化,确定了诱导剂IPTG最适浓度0.4 mM,诱导时间4 h,诱导温度30℃,并通过超声波破碎,SDS-PAGE分析证实了包涵体的存在。利用镍琼脂糖凝胶亲和层析实现了重组ADI的一步纯化,SDS-PAGE分析显示纯化蛋白分子量大小约为49 kDa,与推测大小相符,纯化蛋白比酶活4.76 U/mg。分别考察了pH、温度、金属离子、化学试剂对重组ADI活性的影响,同时考察了它的温度稳定性,测定了酶动力学参数。结果显示重组ADI最适pH为6.0,最适反应温度37℃;除铜离子对重组ADI酶活性有很强的抑制作用外,其他金属离子和化学试剂对重组ADI影响不明显;重组ADI对温度比较敏感,稳定性不高;经测定动力学参数分别为Vmax= 4.92μmol/min·mg,Km= 96.09 mM,推知重组ADI与底物结合力较低。