新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽类的一种高度接触性、急性、烈性传染病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的传染病,我国将其列为一类动物疫病。NDV只有单一血清型,但存在多种基因型,目前我国主要流行的是Class Ⅱ类型中基因Ⅶ毒株,常规疫苗株B1、Clone30、La Sota及V4疫苗株属于基因Ⅰ型和Ⅱ型,不能有效防控基因Ⅶ型毒株。因此,应迫切研发与当前流行株基因型一致的新型疫苗。基于此,本研究对一株NDVHB株进行了全基因组测序,以此为基础建立了HB株的反向遗传操作平台,并对其F蛋白进行改造,旨在为研发基因Ⅶ型NDV弱毒疫苗提供科学依据。从河北省某发病鸡场的临床样本中检测到一株新城疫病毒,命名为HB,采用RT-PCR方法对HB株的全基因组序列进行分段扩增,并对其基因序列进行结构特性分析及同源进化分析。结果表明HB株基因组全长为15192 bp,基因组3’端存在长为55 nt的引导序列,5’端存在长为114 nt的尾随序列,主要编码的6种结构蛋白,包括基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)、核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、以及RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(L),基因组排列顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’。全基因组遗传进化分析表明,HB株属于Class Ⅱ中的基因Ⅶ型毒株,与鸭源新城疫毒株BP01、Fujian/FP/02、MMd/CH/LGD/1/2005核苷酸的同源性最高(99.1%～99.2%),进化树上处于同一分支;与中国广泛使用的V4,Mukteswar和La Sota等疫苗株核苷酸的同源性较低(82.9%～85.6%),进化树上处于不同分支。基于F基因的系统进化树显示,HB株属于基因Ⅶd亚型,是目前我国流行毒株中的优势亚型毒株。通过与其它毒株的序列进行比对,发现在F蛋白的信号肽,七肽重复区和跨膜结构域中出现了 4、16和2个氨基酸突变,在HN蛋白的功能结构域和中和表位分别出现1和5个氨基酸突变,这些关键位点的突变与病毒的吸附性及免疫逃避有关。应用反向遗传操作技术将HB株全长cDNA分为外部基因质粒(M、F及HN)和内部基因质粒(NP、P及L)两部分构建,通过同义突变将L蛋白的3100位点处的碱基A突变为T作为遗传标记,用以与野毒进行区分;利用融合PCR技术将F蛋白的112～117裂解位点的氨基酸序列突变为弱毒株La Sota裂解位点序列,同时构建了三个辅助质粒PCI-NP,PCI-P,PCI-L,将内部基因质粒、外部基因质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞进行病毒拯救,并通过细胞病变、遗传标记检测、基因测序及间接免疫荧光等试验技术对拯救病毒进行鉴定,结果表明,rHB株能在BHK-21细胞上引起典型的细胞病变(CPE),引入的遗传标记在传代过程中可以稳定遗传,F蛋白裂解位点处氨基酸序列突变成功,病毒拯救成功。对拯救病毒的生长特性进行分析,表明rHB株与HB株在BHK-21细胞上具有相似的生长特性。NDV HB株感染性克隆的成功构建可为进一步研究NDV的致病机制和研发新型基因工程疫苗提供技术平台。