背景:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是近年来被人们逐渐认识的一种多因素导致的肝细胞内脂肪蓄积过多的慢性进展性病变。随着社会发展和生活方式的变化,环境污染、药物滥用的广泛存在,近年来NAFLD在全球的发病率不断攀高,对人类的健康和社会的发展构成严重危害。孕烷X受体(PXR)是核受体超家族NR1I2的成员之一,在新陈代谢、机体生长发育以及病理生理过程等方面都发挥着重要的功能,近年发现其在糖异生、脂类代谢以及胆汁平衡中也具有重要的作用。前期研究发现PXR在防御外源物侵袭,加速其体内代谢和排出的同时,也会导致肝脂肪性病变等损伤的发生。目的:通过研究,探讨PXR基因的单核苷酸多态性与NAFLD的相关性,明确PXR在NAFLD中的关键作用。方法:1、采用一代测序检查PXR外显子2中SNP,统计分析其SNP与NAFLD的关联性。收集100例临床外周血液,分为NAFLD组和健康对照组。其中NAFLD组51人,健康对照组49人。分别提取各样品DNA进行聚合酶链式反应(PCR),用1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增得到的目的片段542bp,对PCR产物进行测序。统计分析测序结果,计算相应的基因频率和基因型频率以及各基因型分布在两组间的差异,通过Hardy-Weinberg遗传平衡检测分析样本是否具有群体代表性。2、采用一代测序检查PXR外显子4中SNP,统计分析其SNP与NAFLD的关联性。收集100例临床外周血液,分为NAFLD组和健康对照组,分组情况同上。利用东盛生物试剂盒提取各样品dna,利用超微量蛋白核酸分析仪检测提取出的dna是否符合要求。将符合要求的dna进行pcr实验,用3%琼脂糖凝胶电泳验证扩增得到的目的片段722bp,对pcr产物进行测序。计算相应基因频率和基因型频率,统计分析各基因型在两组间的分布情况,通过hardy-weinberg遗传平衡检测分析样本是否具有群体代表性。3、采用一代测序检查pxr外显子6中snp,统计分析其snp与nafld的关联性。样品来源及分组同上。实验流程与上述相似。利用试剂盒提取各样品dna后进行pcr实验,pcr产物进行3%琼脂糖凝胶电泳实验,判断pcr得到所需目的片段250bp。pcr产物测序。通过hardy-weinberg遗传平衡检测分析样本是否具有群体代表性,统计分析相应基因频率和基因型频率。4、采用一代测序检查pxr外显子8中snp,统计分析其snp与nafld的关联性。样品来源及分组同上。dna提取方法同上,提取dna后进行pcr实验,pcr产物进行3%琼脂糖凝胶电泳实验判断是否得到210bp目的片段。pcr产物测序。通过hardy-weinberg遗传平衡检测分析样本是否具有群体代表性,统计分析相应基因频率和基因型频率。5、采用一代测序检查pxr基因rs2461823位点,统计分析其与nafld的关联性。收集300例临床外周血样,其中nafld组153人,健康对照组147人。从各样品种提取dna,选择合格dna进行pcr实验,pcr产物进行3%琼脂糖凝胶电泳验证pcr产物为383bp目的片段,pcr产物测序。统计分析测序结果计算相应基因频率和基因型频率,通过hardy-weinberg遗传平衡检测分析样本是否具有群体代表性。6、采用一代测序检查pxr基因rs7643645位点,统计分析其与nafld的关联性。实验样品来源分组及dna提取、pcr方法同5。pcr产物进行3%琼脂糖凝胶电泳验证pcr产物为256bp目的片段,pcr产物测序。统计分析测序结果计算相应基因频率和基因型频率,通过hardy-weinberg遗传平衡检测分析样本是否具有群体代表性。7、基于目标区域捕获测序方法探讨pxr基因snp位点与nafld的关联性研究。收集20例临床外周血样,其中nafld组10人,健康对照组10人。从各样品种提取dna,进行目标区域捕获测序,并对pxr基因多态性位点关联分析。结果:1、在pxr基因外显子2中发现两个snp位点,称之为突变1、突变2,。结果显示突变1:两组比较其基因型总体分布差异没有统计学意义(χ2=1.77,p>0.05)。经hardy-weinberg遗传平衡检验,χ2=0.29,0.75<p<0.9,达到遗传平衡(p>0.05),说明样品具有群体代表性。突变2:两组比较其总体分布差异没有统计学意义(χ2=0.10,p>0.05)。经hardy-weinberg遗传平衡检验,χ2=2.00,0.25<p<0.50,达到遗传平衡(p>0.05),说明样品具有群体代表性。2、在pxr基因外显子4中发现1个snp位点,结果显示两组比较其总体分布差异没有统计学意义(χ2=0.58,p>0.05)。经hardy-weinberg遗传平衡检验,χ2=0.12,0.90<p<0.95,达到遗传平衡(p>0.05),说明样品具有群体代表性。3、在pxr基因外显子6及外显子8中暂时未发现突变位点。4、pxr基因rs2461823位点通过测序结果分析,两组间基因型分布比较差异显著有统计学意义(χ2=71.43,p<0.05)。比较两组人群各基因型的分布,结果显示3种基因型在两组均有显著性差异cc(χ2=33.16,p<0.05),tt(χ2=25.86,p<0.05),ct(χ2=50.31,p<0.05)。在等位基因频率分布分析中,rs2461823位点的等位基因频率分布有显著性差异(p<0.0001,or=0.555,95%ci:0.399-0.773)。经hardy-weinberg遗传平衡检验,χ2=1.99,0.25<p<0.5,达到遗传平衡(p>0.05),说明样品具有群体代表性。5、pxr基因rs7643645位点通过测序结果分析,两组间基因型分布比较差异显著有统计学意义(χ2=103.18,p<0.05)。比较两组人群各基因型的分布,结果显示3种基因型在两组均有显著性差异,cc(χ2=42.27,p<0.05),tt(χ2=30.72,p<0.05),ct(χ2=52.91,p<0.05)。经hardy-weinberg遗传平衡检验,χ2=1.51,0.25<p<0.50,达到遗传平衡(p>0.05),说明样品具有群体代表性。6、通过高通量测序筛查到pxr中有120个snp位点,对pxr基因多态性位点关联分析,p均>0.05。结论:1、在本文中发现的PXR基因外显子2及外显子4中的突变可能与NAFLD不相关。2、PXR基因rs2461823位点和rs7643645位点可能与NAFLD相关,且rs2461823位点含等位基因C的基因型(CC和CT)对于NAFLD可能是一个保护因素,为接下来深入研究PXR作为NAFLD治疗靶点以及相关药物开发奠定了基础。