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拟穴青蟹（Scylla paramamosain）是中国东南沿海重要的海水养殖蟹类,养殖过程中持续遭受病原微生物的感染。抗菌肽（Antimicrobial peptide）是青蟹先天免疫系统中的重要效应分子,其具有的广谱抗菌活性、不易产生耐药性等特性使其成为传统抗生素的替代者之一。Crustins是目前蟹类中研究比较广泛的一类抗菌肽,为揭示青蟹抗菌肽Crustin的功能,本论文选取SpCrus5（GenBank登录号MF431586）和SpCrus6（GenBank登录号MF431585）,利用体外重组表达或肽段合成方式,确定抗菌谱和抗菌活性,揭示其杀菌机制。实验结果如下:（1）联合多肽Scy-SpCrus5的真核重组表达及抗菌活性:构建pPIC9K-Scy-SpCrus5真核表达载体,转入毕赤酵母（Pichia Pastoris）GS115进行诱导表达,结果显示,甲醇诱导浓度0.5%,28oC下培养24 h时表达联合多肽Scy-SpCrus5。大量表达后采用镍柱亲和层析纯化,将获得的目的抗菌肽进行体外抗菌活性研究。结果表明,15μM下重组表达的联合多肽,对所选的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌无明显的杀菌作用。（2）Scy-SpCrus5对金黄色葡萄球菌的作用机制:联合多肽Scy-SpCrus5与金黄色葡萄球菌共孵45 min,共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscopy,CLSM）观察抗菌肽与微生物互作后的定位情况,结果显示,联合多肽Scy-SpCrus5可作用于金黄色葡萄球菌细胞表面,而Scygonadin处理下（对照组）无该现象;进一步酶联免疫吸附试验（ELISA）实验研究Scy-SpCrus5与金黄色葡萄球菌细胞壁组分的结合情况,结果显示,在浓度0.5μM时,联合多肽Scy-SpCrus5即可结合脂磷壁酸（Lipoteichoic acid,LTA）,且结合效率与蛋白浓度呈正相关。（3）SpCrus629-47抗菌活性及杀菌动力学曲线:生物信息学分析并预测SpCrus629-47具有抗菌活性,体外合成肽段SpCrus629-47进行抗菌活性实验,革兰氏阳性菌中,对谷氨酸棒状杆菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌有较强的杀菌作用,最小抑制浓度（Minimal inhibitory concentration:MIC）为624μM;革兰氏阴性菌中,对荧光假单胞菌、施氏假单胞菌抑杀作用较弱,MIC为2448μM,对大肠杆菌模式株、弗氏志贺氏菌无抗菌活性,MIC为48μM,结果表明,SpCrus629-47对革兰氏阳性菌有更强抗菌活性。杀菌动力学曲线实验结果显示,当SpCrus629-47与金黄色葡萄球菌共孵5 min时,杀菌指数为50%,共孵2 h后,杀菌指数达到100%。（4）初步揭示SpCrus629-47对金黄色葡萄球菌的杀菌机制:当合成肽SpCrus629-47与金黄色葡萄球菌共孵45 min时,扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）观察到细菌细胞表面粗糙,表面结构崎岖不平,出现大量细胞碎片,而对照组细菌细胞光滑、完整、细胞形态未改变。透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观察到细胞质膜破裂,甚至完全消失,细菌周围出现碎片,而对照组细菌细胞质膜完整,膜结构清晰可见且连续。流式细胞仪分析SYTO 9/PI的摄入情况,结果显示,SpCrus629-47处理后的金黄色葡萄球菌对荧光染料PI的摄入量明显增多,揭示SpCrus629-47可以改变金黄色葡萄球菌细胞质膜的通透性。