大鼠脑、肝组织RNA相对表达量与死亡时间的关系

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目的研究大鼠脑、肝脏组织3种RNA相对表达量与死亡时间(postmortem interval,PMI)的关系,比较两组织用于死亡时间推断的可能性,为RNA在死亡时间推断方面的应用提供理论依据。方法将48只Wistar大鼠随机分为6组,断颈处死后置于海拔2260 m、室温12±1℃、湿度40±2%的环境中,分别于死后0 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h取大鼠脑皮质及肝右外叶。将一部分脑和肝组织用4%多聚甲醛固定后进行HE染色制片观察。另一部分脑、肝组织提取总RNA,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)技术检测两组织中miRNA(脑特异性miR-124、肝特异性miR-122)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)m RNA的循环阈值(cyclic threshold,Ct)。用Best Keeper程序筛选内参,对目的RNA的Ct值进行2-ΔΔCt转换,用SPSS及Graph Pad软件对其进行单因素方差分析;并对ΔCt值进行曲线回归分析,构建回归模型。结果1、脑组织中miR-124的标准差(standard deviation,SD)和变异系数(coefficient of variation,CV)最小,肝组织中miR-122的SD和CV最小。2、脑组织GAPDH、β-actin m RNA的相对表达量2-ΔΔCt在死后72 h内逐渐增加,并于死后72 h达到峰值,之后逐渐下降(P<0.05);而肝GAPDH、β-actin m RNA的相对表达量2-ΔΔCt在死后24 h内不变,从死后48 h开始逐渐下降(P<0.05)。3、所有目的RNA分子的ΔCt值与PMI的最适回归模型均为三次模型,且肝组织的相关系数r大于脑组织。最适模型的回归方程分别为:y脑GAPDH m RNA=3.280-0.028x+2.343×10-4x2-5.440×10-7x3,y脑β-actin m RNA=4.231-0.039x+3.985×10-4x2-1.103×10-6x3,y肝GAPDH m RNA=4.965-4.460×10-3x+4.328×10-4x2-1.666×10-6x3,y肝β-actin m RNA=5.660-0.019x+6.064×10-4x2-1.947×10-6x3。结论1、通过内参筛选,认为miR-124和miR-122可以分别作为脑、肝组织的内参。2、在海拔2260 m、温度12±1℃、湿度40±2%的条件下,大鼠脑组织中GAPDH、β-actin m RNA的相对表达量2-ΔΔCt在死后72 h内逐渐增加,并在72 h达到高峰,之后逐渐下降;大鼠肝组织中GAPDH、β-actin m RNA的相对表达量2-ΔΔCt在死后24 h内不变,从死后48 h开始逐渐下降,肝组织比脑组织更适用于死亡时间推断。3、在海拔2260 m、温度12±1℃、湿度40±2%的条件下,大鼠脑、肝组织中GAPDH、β-actin m RNA的ΔCt值与死亡时间的最适回归模型均为三次模型。
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