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一、研究背景microRNAs (miRNA)是一类广泛存在于多种生物体的非编码小RNA,其长度通常为22bp左右。microRNAs分子可通过与靶基因的3’非翻译区(3’UTR)完全或不完全的配对来降解靶基因mRNA或抑制其翻译,从而在转录后水平负调控靶基因的表达。通过对靶基因的负向调控,microRNA参与调节着多种生物学过程,如早期发育、细胞增殖和分化、细胞凋亡等,而miRNA的异常则与多种疾病和肿瘤相关。目前研究发现约50%己得到注解的microRNAs在人类基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点；某些组织特异性microRNA基因表达图谱的改变可见于乳腺癌、直肠结肠癌、肺癌、垂体瘤、胶质细胞瘤等多种肿瘤组织中,提示表明miRNAs在肿瘤的发生发展中起重要作用。目前认为,miRNAs在肿瘤的发生发展既可作为抑癌基因下调原癌基因的活性,也可作为癌基因下调抑癌基因的活性。因此研究miRNA在肿瘤中的作用有助于全面而深入地探索肿瘤发生发展的分子机制,并可为肿瘤的临床诊断与治疗提供新靶点。1et-7家族是最早发现的miRNA之一,在成人组织中广泛表达(has-let-7),以肺组织的表达丰度最高。Takamizawa等发现肺癌患者的let-7表达水平显著降低,并且let-7表达水平低的患者经手术切除治疗后,预后较差。体外细胞培养实验表明,在人肺癌细胞中高表达1et-7则可以抑制肺癌细胞的增殖。这说明1et-7是具有抑癌作用的miRNA,与肺癌高度相关,有望成为肺癌分子靶向治疗的一个新靶点。目前对let-7在肺癌组织细胞中低表达的机制尚缺乏全面信息,而Takamizawa及Yanaihara等研究者通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测到在肺癌组织细胞中pri-hsa-let-7表达水平下降,提示转录水平的调控异常至少是hsa-let-7(?)低表达的部分原因。但目前对hsa-let-7的转录调控机制仍知之甚少。本课题选取let-7家族中含量最丰富,且成簇位于9q22.32的1et-7a-1和let-7f-1作为切入点,对其转录调控机制进行初步研究。二、研究目的鉴定miRNA簇1et-7a-1/7f-1的转录起始点,克隆其启动子,并对let-7a-1/7f-1启动子的功能进行初步分析,为探讨let-7a-1/7f-1在肺癌细胞中的转录调控机制奠定基础。三、实验方法首先通过5’RACE确定1et-Ta-1/7f-1的转录起始点,继而通过PCR扩增1et-7a-1/7f-1基因5’上游2123bp的启动调控区片段(-1999bp/+124bp),插入荧光素酶报道基因质粒pGL3-Basic,构建let-7a-1/7f-1启动子-荧光素酶报道基因质粒pGL3-2123,瞬时转染肺癌细胞A549,检测其启动子活性。然后对pGL3-2123的启动子功能进行初步分析。pGL3-2123瞬时转染A549细胞,分别经过9-顺维甲酸(9cRA)、全反式维甲酸(AT-RA)、地塞米松(DEX)或1,25-(OH)2D3处理48h或将pGL3-2123分别与真核表达载体pCMV-p53, pcDNA3.1(+)-Sp1, pcDNA3.1(+)-NF κ Bp50, pcDNA3.1(+)-PPAR γ2, pcDNA3.1(+)-c/EBP α, pBABEpuro-ras或pBABEhygro-myc共转染A549细胞48h,收取细胞,进行双荧光素酶活性的检测,观察它们对A549细胞中let-Ta-1/7f-1启动子活性的影响。四、实验结果通过5’RACE,确定了let-7a-1/7f-1的转录起始点；PCR扩增的let-7a-1/7f-i基因5’上游2123bp启动子片段与荧光素酶报告基因质粒构建成的融合质粒(pGL3-2123)经酶切电泳及测序鉴定正确；pGL3-2123质粒转染A549细胞48h后,双荧光素酶活性测定M1/M2为5.24,而pGL3-control和pGL3-basic的相对荧光素酶活性M1/M2分别为38.76和0.26。DEX能够增强1et-7a-1/7f-1启动子的活性,但ATRA,9cRA,1,25-(OH)2D3对let-Ta-1/7f-1启动子的活性没有产生明显影响。肿瘤相关因子c/EBPα和p53的真核表达载体与pGL3-2123共转染时,能够增强1et-7a-1/7f-1的启动子活性；而共转染的PPARγ2,NF-KappaB,Spl,raS和myc的真核表达载体对let-7a-1/7f-1启动子的活性没有明显影响。五、实验结论成功鉴定了microRNA簇1et-7a-1/7f-1的转录起始点,构建了2.1kb的let-7a-1/7f-1启动调控区-荧光素酶报告基因质粒pGL3-2123；该质粒经瞬时转染和报告基因分析,检测到了明显但相对于阳性对照较低的启动子活性,这与let-7a-1/7f-1在肺癌A549细胞中发生了表达下调相一致。肿瘤相关因子c/EBPα和p53以及糖皮质类激素药物地塞米松(DEX)能够增强肺癌细胞中该启动子的转录活性。这一研究结果为进一步深入研究hsa-1et-7基因的表达调控机制及其在肺癌发生发展中的作用奠定了基础。