一、逆转录病毒双顺反子载体介导的耐药基因ALDH1与MDR1共表达 骨髓抑制是化疗失败的重要因素之一，如何提高病人对化疗的耐受性，一直是人们所关注的问题。将耐药基因导入骨髓细胞使之获得耐药表型，就可以增加骨髓对化疗药物的耐受性，这将为临床超剂量化疗以求最大限度地清除肿瘤细胞提供了可行性。对造血细胞转导耐药基因以保护骨髓免受化疗药物的细胞毒性作用是肿瘤基因治疗的一大策略。 为了适应联合化疗的需要，可以对造血细胞同时转导不同类型的耐药基因，以扩大造血细胞的耐药范围。环磷酰胺、长春新碱、紫杉醇、阿霉素、柔红霉素等是临床最常应用的化疗药物。ALDH1基因表达醛脱氢酶，能氧化环磷酰胺的中间代谢产物醛磷酰胺，形成无毒的羧基磷酰胺，从而发挥对环磷酰胺的解毒作用；多药耐药基因MDR1可编码一种膜糖蛋白P170，依赖ATP将药物泵出胞膜，转导MDR1可传递对长春新碱、紫杉醇、阿霉素、柔红霉素等药物的耐受。 在共表达双基因的方法中，含内在核糖体进入位点（IRES）的双顺反子策略倍受关注。IRES来源于豆核病毒（脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒）5′端非翻译区，能引导核糖体直接进入mRNA开始帽非依赖性翻译。采用IRES双顺反子载体，以LTR单启动子驱动上下游两个基因转录并获得相同水平的双蛋白表达，避免了双启动子自相抑制作用。一方面，IRES双顺反子载体能引导不同类型的耐药基因有效共表达，可用于扩大耐药范围；另一方面，将选择基因与功能基因相联结，可进行体内富集、选择，以实现外源基因的长期稳定表达。 逆转录病毒介导的耐药基因转移以保护造血功能的实验研究 我们应用基因重组技术构建逆转录病毒双顺反于载体 GIN才 ALDHI－IRES－MDRI（GINa－AIM），经酶切、测序鉴定；将重组载体 GINa－AIM酶切（Ndel）线性化，在预置电压 l～3 by／cm，电容 125 u F条件下电穿孔法转导包装细胞 PA317，予 VCR15ng 加l筛选 2周， 至抗性克隆出现，PCR证实外源基因整合后，扩大培养获病毒生产细 胞PA3八IM。通过单嗜性GP丘86 细胞与双嗜性病毒生产细胞 PA317从IM交互感染（乒乓效应）增加原病毒整合的拷贝数，从而提 高病毒上清滴度。 在以人造血细胞系K562 为模型的体外实验中，我们用重组病毒 上清转染K562细胞，分别以PCR、Southern blot证实转移基因的整 合，RT干CR检测转移基因的转录，流式细胞仪分析转移基因的表达 强度及转导效率，MTT 药物敏感性试验测定转移基因的耐药表型。并 且用筑巢式PCR检测辅助病毒的存在，分析该逆转录病毒转移系统的 安全性。 结果显示：应用电穿孔法将携带大容量基因片段的载体成功地转 ；”导了 pA317细胞并获得有效包装，电穿孔技术对于转移H 的大片 段基因具有独特的优势；优化电穿孔法的各项参数如细胞大小、电场 强度、持续时间、频率、脉冲总量等，可提高转导效率，我们应用 cytomix 穿孔液，冰浴处理，高电压、短脉冲，并将基因片段酶切线 性化，以提高瞬时和长期表达水平。 乒乓感染后双嗜性病毒上清由lx10、fu加 提高到 lxlo’cfu／ml，提高了 10 倍。本文采用的载体GINa－AIM大小为 11kb， 接近逆转录病毒的包装极限，因而获得的重组病毒上清滴度较低，通 过药物选择及乒乓感染，可提高病毒上清滴度，说明加压筛选可弥补 共表达载体过长的缺陷。 PCR、Southern blot、RT－PCR、FCM检坝到双基因ALDHI 与MDRI 在病毒生产绍胞PA317／AIM及靶细胞K562从 中的整合与表达。与 母本细胞K562相卜较，K562／AIM对个 氢过氧环磷酚胺（4－HC）与VCR 的耐药性门。。）分别提高 3～10倍，显示同时获得 ALDHI、MDRI双 逆转录病毒介导的耐药基因转移以保护造血功能的实验研究 基因不同程度的功能表达［‘］，说明该载体系统有效进行了基因转移并 传递了耐药表型。逆转录病毒IRES双顺反子载体能介导不同类型的 耐药基因有效共表达，可用于扩大耐药范围，并进行体内显性选择。 筑巢式PCR在基因修饰的K562／AIM细胞中未检测到辅助病毒， 提示该转移方式和传送系统是安全可靠的。 二、逆转录病毒介导的以造血干细胞为靶细胞的基因转导条件的优化 具有无限增殖潜力的造血干细胞＊SC），可在体外培养、扩增， 是较为理想的基因转移靶细胞；具有整合功能的逆转录病