目的:肝癌在我国是一种高发性肿瘤，恶性程度高，预后差；治疗手段有限，效果不佳。肝癌的发生是多基因、多步骤、多阶段的复杂过程。其病因主要有：病毒感染、肝硬化、黄曲霉素、化学制癌物及寄生虫感染等。对于肝癌的发病机制，普遍认为与癌基因的激活，抑癌基因的失活，染色体非整倍体的出现等遗传因素有关，与细胞周期、细胞周期调节点失调控关系密切；亦与甲基化等表观遗传学改变关系密不可分，但其具体发病机制尚不清楚。因其发病机制的不确定性及早期诊断困难等因素存在，以及术后的复发率高，对大多数患者来说仍然缺乏有效的治疗。因此，阐明肝癌的发病机制，争取早期诊断，寻求有效的治疗手段是人们急待解决的重要课题。当今，遗传学研究仍然是肝癌发病机制的热点，基因治疗作为治疗肝癌的新手段也日益受到人们的重视。相对与因功能获得性变异而导致的癌基因激活，抑癌基因的失活源自功能失去性变异，提高了肿瘤易感性，在肿瘤的发生、发展过程中起着更大的作用。虽然已经发现RB1，p53和K-ras等抑癌基因的某些变异与肝癌的发生、发展有关，但到目前为止，尚没有一种基因成为大多数HCC的主要抑制基因，因此，有必要研究新的抑癌基因来阐明肝癌的发病机制，并寻求行之有效的新靶点进行肝癌基因治疗。本课题选用一个新近发现核转录因子-KLF6，该基因为近年发现的Kruppel-like家族中的成员。相关研究表明，KLF6具有抑制细胞生长的作用，有可能是作用广泛的抑癌基因。所以推测KLF6基因在肝癌发病机制及未来的基因治疗可能会发挥重要作用。本课题通过研究KLF6基因在肝细胞癌生物学行为，进一步探讨肝癌的发病机制以及以KLF6基因作为肝癌基因治疗新靶点的可能性。首先检测了KLF6基因在肝癌组织及肝肿瘤细胞中的表达；其次，成功构建了KLF6基因真核表达质粒并导入肝癌细胞株HepG2细胞中，观察KLF6基因对细胞生长及生物学行为的影响;最后根据Knudsen“两次打击”模式，分别采用DNA直接测序和茵光标记的多态性微卫星技术检测KLF6基因是否在肝癌组织中发生遗传变异。 方法:收集同济医院2003-2004年肝胆外科中心手术切除的肝癌标本26例(每例均有癌组织及癌旁组织)，患者于手术前未经任何抗癌治疗。另选3株细胞，其中，2株肝肿瘤细胞即HepG2、Hep3B，1株正常肝细胞L02。分别用Real-timequentifictionPCR和RT-PCR法检测上述组织及细胞中KLF6mRNA的表达水平；用免疫组织化学及WesternBlot法检测上述研究对象中KLF6蛋白的表达。根据KLF6cDNA序列设计引物，用RT-PCR方法获得KLF6基因全长DNA片段，双酶切后将KLF6基因片段插入真核表达载体pcDNA3.0中，构建KLF6基因真核表达质粒pcDNA3.0/KLF6。重组质粒经酶切测序正确后瞬时转染HepG2细胞，RT-PCR法检测转染细胞中KLF6mRNA的表达水平，同时采用细胞免疫化学及WesternBlot法检测KLF6蛋白的表达，MTT法检测转染细胞的生长情况。以KLF6基因真核表达质粒pcDNA3.0/KLF6转染HepG2细胞，G418筛选获得稳定转染细胞株，然后再检测瞬时转染细胞的有关项目及软琼脂克隆形成能力。分别采用DNA直接测序和茵光标记的多态性微卫星技术检测KLF6基因在肝癌组织中的突变和杂合子缺失。 结论:1.KLF6基因在肝癌及肝肿瘤细胞中的呈明显的表达下调。迄今，这是首次实验发现；KLF6基因为普遍表达的核转录因子，肝癌中KLF6基因表达失调是肝癌发生的重要遗传学改变之一2.KLF6基因可抑制肝癌细胞HepG2细胞的生长，并诱导其凋亡的发生，具有抑癌基因的部分特性；3.KLF6基因在原发性肝癌中表现出频繁的基因变异事件：点突变和杂合子缺失。根据Knudsen“两次打击”模式，KLF6基因可能为肝癌新的抑癌基因。