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自第一例冷冻胚胎解冻移植的试管婴儿出生,30年间,胚胎冷冻保存技术已取得巨大的进步。目前,胚胎低温保存在辅助生殖技术(Assisted reproductive technology,ART)实验室已经成为常规技术,部分生殖医学中心甚至会对特殊患者采用全胚冷冻治疗方案。但在胚胎的原始生殖干细胞、配子发生和植入前胚胎阶段,会发生全基因组的表观遗传重编程。表观遗传对植入前胚胎发育具有重要影响,这个阶段产生的表观遗传改变,可能会影响子代的整个生命过程。而ART技术正是在这个敏感时期对胚胎进行操作,包括胚胎的玻璃化冷冻解冻。既往研究中发现,胚胎玻璃化冷冻解冻移植后子代表观遗传模式出现异常,这提示我们玻璃化冷冻可能增加表观遗传紊乱的风险从而影响子代长时程的健康。临床流行病学调查也发现,冻胚移植可以增加多囊卵巢综合征妇女妊娠期子痫的发生,出生子代中,冻胚移植后子代巨大儿的发生率明显增加。所以这项技术的安全性及其风险仍然需要进一步的临床和基础研究进行评估,需要更多的临床和基础研究揭示玻璃化冷冻技术对表观遗传的影响及其调控机制。本研究中,我们利用小鼠模型,研究玻璃化冷冻技术对胎儿和胎盘组织的表观遗传影响及印记基因改变,并探索其相关调控机制。第一部分:玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿生长发育的影响目的:建立玻璃化冷冻解冻胚胎移植小鼠模型,探讨8细胞期小鼠胚胎进行玻璃化冷冻解冻后移植,小鼠孕9.5天胎儿生长发育的情况。方法:实验分为三组,自然妊娠(Natural conception,NC)组,胚胎体外培养(In vitro culture,IVC)组和胚胎玻璃化冷冻解冻(Vitrified embryo transfer,VET)组。分析三组小鼠孕9.5天的胎儿存活率并比较三组孕母鼠在孕9.5天胎儿的头臀径。结果:(1)存活率分析显示,NC组胎儿全部存活(100%),而IVC组和VET组的胎儿存活率分别为40.2%和37.5%,与NC组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);IVC组与VET组两组比较,胎儿存活率未发现统计学差异(P>0.05);(2)比较三组胎儿的头臀径,与NC组相比(0.288±0.083 mm),IVC组(0.210±0.059 mm)和VET组(0.205±0.048 mm)胎儿的头臀径显著减小,差异具有统计学意义(P<0.05),但IVC组和VET组之间比较没有显著性差异(P>0.05)。结论:玻璃化冷冻技术可影响胚胎的发育潜能,导致孕早中期胎儿存活率显著下降;玻璃化冷冻技术也可影响胎儿的宫内生长发育,导致孕早中期出现胎儿宫内生长发育迟缓的现象。第二部分:玻璃化冷冻技术对小鼠胎儿和胎盘印记基因表达的影响及其甲基化调控机制研究目的:建立玻璃化冷冻解冻胚胎移植小鼠模型,研究胚胎的玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿及胎盘印记基因表达其印记调控区甲基化水平影响。方法:实验分为三组,自然妊娠(NC)组,胚胎体外培养(IVC)组和胚胎玻璃化冷冻解冻(VET)组,在孕母鼠孕9.5天收集小鼠胎儿及胎盘,荧光定量聚合酶链反应法检测三组胎儿和胎盘中9个父源表达印记基因(Dlk1,Igf2,Kcnq1ot1,Me st,Ndn,Peg3,Plagl1,Sgce,Snrpn)和15个母源表达印记基因(Cd81,Cdkn1c,Dcn,Gatm,Gnas,Grb10,Gtl2,H19,Igf2r,Mash2,Osbpl5,Phlda2,Slc22a18,Ube3a,Zim1)的表达水平;并利用焦磷酸测序法检测印记基因H19和Kcnq1ot1的ICR调控区的甲基化水平。结果:(1)胚胎的玻璃化冷冻对小鼠胎儿组织父源表达印记基因表达的影响。与N C组相比,IVC组Peg3表达上调(NC:0.746±0.233;IVC:1.396±0.592),VET组Igf2(NC:1.223±0.299;VET:2.048±0.537),Peg3(NC:0.746±0.233;VET:1.981±0.238)表达上调,VET组的Ndn(NC:1.198±0.229;VET:0.699±0.227),Sgc e(NC:1.112±0.147;VET:0.694±0.187)表达下调,以上差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎盘组织父源表达印记基因表达的影响。与NC组相比,IVC组Mest表达下调(NC:0.894±0.257;IVC:0.511±0.251),VET组Igf2(NC:1.063±0.19;VET:0.686±0.177),Ndn(NC:0.986±0.092;VET:0.627±0.291),Sgce(NC:0.943±0.133;VET:0.589±0.177)的表达下调,Kcnq1ot1(NC:1.127±0.357;VET:5.242±2.737)的表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎儿组织母源表达印记基因表达的影响。与NC组相比,IVC组共有10个基因的表达上调(Cd81,Gatm,Gnas,Grb10,H19,Igf2r,Mash2,Obspl5,Slc22a18,Ube3a),1个基因表达下调(Cdkn1c);VET组共有9个基因表达上调(Gnas,Grb10,Gtl2,H19,Igf2r,Mash2,Obspl5,Phlda2,Slc22a18),2个基因表达下调(Cdkn1c,Dcn),差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎盘组织母源表达印记基因表达的影响。与NC组相比,IVC组Slc22a18(NC:0.964±0.071;IVC:0.426±0.093),Ube3a(NC:1.049±0.098;IVC:0.583±0.116)的表达下调,VET组Cdkn1c(NC:0.916±0.118;VET:0.590±0.245),Gnas(N C:0.911±0.269;VET:0.562±0.257),Slc22a18(NC:0.964±0.071;VET:0.376±0.080),Ube3a(NC:1.049±0.098;VET:0.362±0.171)的表达下调,差异具有统计学意义(P<0.051)。(5)胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎儿和胎盘组织印记基因H19的ICR调控区甲基化水平的影响。无论在小鼠胎儿还是胎盘组织,三组H19基因的ICR调控区甲基化水平均未发现统计学差异(P>0.05)。(6)胚胎玻璃化冷冻对小鼠胎儿和胎盘组织印记基因Kcnq1ot1的ICR调控区KvDMR1区甲基化水平的影响。在胎鼠组织中,相比于NC组,IVC组和VET组KvDMR1区的甲基化水平无统计学差异(P>0.05),但是,相比于IVC组(0.364±0.129),VET组KvDMR1区的甲基化水平(0.464±0.109)上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。在胎盘组织中,相比于NC组(0.425±0.062),IVC组(0.358±0.114)和VET组(0.343±0.094)KvDMR1区的甲基化水平均下降,差异具有统计学差异(P<0.05)。结论:首先,相比于NC组,IVC组和VET组小鼠胎儿发生宫内生长发育迟缓,且IVC组和VET组小鼠胎儿组织出现大量母源表达印记基因表达水平显著上调,根据父母印记冲突学说,母源表达印记基因限制胎儿宫内生长,以尽量保存母体资源,提示IVC组和VET组小鼠胎儿组织母源表达印记基因的紊乱可能是导致胎鼠宫内生长发育迟缓的潜在机制之一。其次,相对于NC组,IVC组和VET组的胎盘组织印记基因Kcnq1ot1表达上调,而该表达异常可能与Kcnq1ot1的ICR调控区即KvDMR1区域的甲基化水平改变有关,并且我们发现,在胎盘组织中印记基因Kcnq1ot1所调控的一系列下游母源表达印记基因包括Osbp15,Phlda2,Slc22a18,Cdkn1c和Cd81均有下降,鉴于此区域对胎盘发育和功能具有重要作用,因此需关注此区域印记基因表达改变对胎盘后期功能及表型的影响。第三部分:玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿和胎盘总甲基化水平的影响及其调控机制研究目的:探究玻璃化冷冻技术对小鼠孕9.5天胎儿及胎盘总甲基化水平的影响及其调控机制。方法:实验分为三组,自然妊娠(NC)组,胚胎体外培养(IVC)组和胚胎玻璃化冷冻解冻(VET)组,在孕母鼠孕9.5天收集小鼠胎儿和胎盘,利用酶联免疫法检测三组小鼠胎儿和胎盘中总DNA甲基化水平;并利用荧光定量聚合酶链反应检测三组小鼠胎儿和胎盘中甲基化转移酶Dnmts和去甲基化酶Tets的表达水平。结果:(1)在小鼠胎儿组织中,相对于NC组(0.0324±0.0185),IVC组的全基因组DNA甲基化水平显著下降(0.0146±0.0144,P<0.05),而经过玻璃化冷冻解冻步骤之后,VET组的总甲基化水平转而上升至与NC组无显著性差异(0.0321±0.0209,P>0.05)。相比于IVC组(0.0146±0.0144),VET组(0.0321±0.0209)的总甲基化水平显著性升高(P<0.05)。在胎盘组织中,相比于NC组(0.0292±0.0221),IVC组(0.0049±0.0033)和VET组(0.0117±0.0073)的总甲基化水平均下降,且差异具有统计学意义(P<0.05)。相比于IVC组(0.0049±0.0033),VET组(0.0117±0.0073)的总甲基化水平显著性升高(P<0.05)。(2)在小鼠胎儿组织中,相比于NC组,IVC组和VET组的Dnmt1(NC:0.637±0.267;IVC:3.343±1.037;VET:14.337±6.373)和Dnmt3b(NC:0.898±0.218;IVC:2.625±1.168;VET:5.825±2.456)表达均上调,VET组的Tet2(NC:0.941±0.133;VET:0.334±0.104),Tet3(NC:0.958±0.088;VET:0.300±0.056)的表达均下调,差异均具有显著性意义(P<0.05)。胎盘组织中,相比于NC组,VET组的Dnmt1(NC:1.105±0.604;VET:3.928±1.236)表达显著性上调(P<0.05)。结论:玻璃化冷冻技术致小鼠胎儿和胎盘的甲基化模式改变,这种改变,可能与甲基化转移酶和去甲基化酶的表达水平改变相关。第四部分:玻璃化冷冻技术对植入前小鼠胚胎发育的影响及其机制研究目的:探究玻璃化冷冻技术对小鼠植入前胚胎的发育影响及其机制。方法:实验分为三组,自然妊娠(NC)组,胚胎体外培养(IVC)组和胚胎玻璃化冷冻解冻(VET)组,收集三组8细胞期和囊胚期胚胎。分析IVC组和VET组小鼠胚胎的囊胚发育率和囊胚孵出率;并利用荧光定量聚合酶链反应检测三组胚胎中多潜能因子和胚胎早期细胞命运决定因子的表达水平。结果:(1)IVC组的囊胚形成率为89.02%(73/82),略高于VET组的囊胚形成率80%(68/80),但是二者差异没有统计学意义(P>0.05)。IVC的囊胚孵出率为93.15%(68/73),显著高于VET组的囊胚孵出率80.88%(55/68),差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)比较NC组,IVC组和VET组8细胞期的胚胎中多项潜能因子Nanog,Pou5f1和Lif的转录水平表达情况,结果显示:与NC组相比,VET组Nanog的表达水平明显上调(NC:0.315±0.119;IVC:1.004±0.267),IVC组和VET组的Lif的表达水平明显下调(NC:1.390±0.353;IVC:0.667±0.194;VET:0.101±0.020),差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)比较NC组,IVC组和VET组囊胚期的胚胎中多潜能因子和早期细胞命运分化因子的表达水平。相比于NC组,IVC组和VET组的多项潜能因子Pou5f1,Nanog和Sox2表达不同程度的下降。滋养层细胞分化基因Tead4在IVC组中显著上调,在VET组中显著下降(P<0.05)。滋养层细胞分化基因Cdx2,Eomes和Elf5在IVC组和VET组的表达均显著下降(P<0.05)。调控原始外胚层分化的基因Gata6,Sox17,Fgfr2以及Fgfr4在IVC组和VET组的表达也有不同程度的下降。Lif支持卵裂期细胞和囊胚发育,促进胚胎着床能力,相比于NC组,该基因也在IVC组和VET组显著下降(P<0.05)。结论:体外培养和玻璃化冷冻技术均可导致小鼠囊胚孵出率显著下降,而玻璃化冷冻技术对其影响更大。相对于NC组,IVC组和VET组的胚胎多潜能因子及早期胚胎命运决定基因表达水平显著下调,这可能是IVC和VET导致囊胚孵出率下降及胚胎早期发育潜能受损的原因。