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目的:本研究旨在从不同角度对半硫丸的毒性及毒理机制进行深入研究。一方面从基因水平,根据机体基因表达的变化来研究和预测半硫丸对肝脏的潜在毒性机制,另一方面围绕硫磺,将半硫丸进行拆方组合以明确半硫丸中各药物在毒性发挥方面的具体作用。 方法: 实验一:对半硫丸及硫磺、硫磺半夏、硫磺姜汁半数致死量的测定 动物及分组:健康昆明种小鼠200只（由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）,雌雄各半,体重20±2g;将小鼠称重标记,随机分为半硫丸、硫磺、硫磺半夏及硫磺姜汁给药组各4组。根据预实验所得结果:半硫丸给药的0%（Dn）和100%（Dm）死亡率的剂量分别为8.32g/kg与44.84 g/kg;硫磺给药的0%（Dn）和100%（Dm）死亡率的剂量分别为13.53g/kg与58.34g/kg;硫磺半夏给药的0%（Dn）和100%（Dm）死亡率的剂量分别为4.64g/kg与21.27g/kg;硫磺姜汁给药的0%（Dn）和100%（Dm）死亡率的剂量分别为26.56 g/kg与117.04g/kg,上述各组Dm/Dn的倍数均为4倍左右,根据人民卫生出版社94年出版的中药药理实验教材LD50选择分组与剂量比值简表,确定各组组内组间药物剂量比值为1∶0.7,由此确定半硫丸给药为5组;硫磺给药为5组;硫磺半夏给药为5组;硫磺姜汁给药为5组。随机再将各组小鼠进行分组,每组各10只。给药方法:将小鼠禁食24小时后,各组分别灌服相应剂量、浓度药液的1/3剂量0.5 ml/次,连续给药3次,每次间隔2小时。观测方法:给药后逐日观察7天,详细记录死亡数目。统计方法:统计软件bliss分析实验结果,计算LD50及其95%置信期间。 实验二:半硫丸及硫磺、硫磺半夏、硫磺姜汁一般毒性的实验研究 动物及分组:健康Wistar大鼠140只（由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）,雌雄各半,体重182±15.5g,随机分为7组,每组20只:正常对照组、半硫丸小剂量组、半硫丸中剂量组、半硫丸大剂量组、硫磺大剂量组、硫磺半夏大剂量组、硫磺姜汁大剂量组。给药方法:根据测定的各组半数致死量(LD50)数值,半硫丸的大、中、小剂量分别采用半硫丸LD50的1/10,1/50,1/100,硫磺大剂量组、硫磺半夏大剂量组、硫磺姜汁大剂量组则采用各自LD50的1/10的剂量。各组分别灌服相应剂量、浓度的药液0.5 ml/次,正常对照组灌服相应剂量的生理盐水,每日1次,时间90天。指标检测:观察动物实验前后活动、毛发、粪便性状及进食等情况。每周称重1次,并按体重调整给药量。最后一次用药后,禁食不禁水24小时,每组取一半数目的大鼠进行眼眶取血,做血常规（血红蛋白、红细胞、白细胞、血小板）和肝功能（谷丙转氨酶、谷草转氨酶）、肾功能（尿素氮、肌酐）等生化指标的检测,然后将大鼠断头处死,取脏器肝、肾、心、脑、甲状腺,进行病理组织学检查。其余动物停止给药,继续饲养2周做可逆性观察。2周后按如上方法进行检测。统计方法:实验数据应用SPSS软件进行方差分析。 实验三:利用毒理基因芯片分析半硫丸对大鼠肝脏毒性的作用机制博士学位论文 具体实验步骤及方法同实验二,药物灌胃3个月,处死动物,取半硫丸大剂量组与正常对照组动物的肝脏组织100mg,放于液氮中待用。之后利用毒理基因芯片,经过RNA抽提、RNA质量检测、探针合成、芯片杂交、化学发光检测、图象采集和数据分析等步骤对其毒性作用机制进行具体分析。结果:1实验一实验结果显示:半硫丸及硫磺、硫磺半夏、硫磺姜汁半数致死量分别为:20.53 x4g/kg,30.43559/kg,9.79079/kg与50.06629/kg。2实验二结果:2,1一般情况:在整个实验过程中,正常对照组以及半硫丸中、小剂量组、硫磺姜汁大剂量组均未见动物死亡,进食活动有规律,皮毛有光泽;半硫丸大剂量组、硫磺大剂量组以及硫磺半夏大剂量组分别有5、4、5只大鼠死亡,灌胃过程中逐渐出现精神萎靡,进食活动无明显改善,毛发蓬乱且发黄,失去原来光泽。2.2动物血常规变化情况:各用药组与正常对照组比较均无显著性差异（p>0.05）,与实验后再饲养2周的结果亦无明显差异（p>0.05）,各组数据均在正常范围。2.3对大鼠肝肾功能的影响:肝功能的测定中半硫丸中、小剂量组、硫磺姜汁大剂量组与正常对照组相比无显著性差异（p>0.05）,与实验后再饲养2周的结果亦无明显差异（p>0.05）,各组数值均在正常范围内。半硫丸大剂量组、硫磺大剂量组以及硫磺半夏大剂量组与正常对照组相比有显著性差异（p<0.05）,与实验后再饲养2周的结果无明显差异（p>0.05）,各组数值均超出正常范围,数值依次大小为:硫磺半夏大剂量组、半硫丸大剂量组、硫磺大剂量组。各组的肾脏功能与正常对照组无显著性差异（p>0.05）,与实验后再饲养2周的结果无明显差异（p>0.05）,各组数值均在正常范围内。2.4病理学检查:放血处死各组动物后,尸解对脏器进行肉眼观察未发现异常现象。对肝、肾、心、脑、甲状腺等实质脏器进行病理组织学检查。结果表明:半硫丸大、中剂量组,硫磺大剂量组以及硫磺半夏大剂量组均可见不同程度的肝细胞浊肿变性,部分区域可见炎性细胞浸润,以硫磺半夏大剂量组、半硫丸大剂量组损害程度为重。硫磺半夏大剂量组肾脏内可见部分肾小管水肿变性,其它各组未见明显异常。3实验三基因谱分析显示:半硫丸大剂量组肝细胞内与凋亡有关的基因