研究背景体外受精-胚胎移植技术在过去40多年时间里飞速发展,胚胎种植率、临床妊娠率也不断提高。随之而来的一个值得关注的并发症是多胎妊娠。根据中华医学会生殖医学分会数据上系统统计,2016年我国生殖医学的多胎妊娠率超过30%,甚至有的生殖中心多胎妊娠率高达40%。人类辅助生殖技术引起的多胎妊娠往往与妊娠期高血压疾病、子痫前期、前置胎盘、择期剖宫产、产后出血、早产、极早产、低出生体重等产科并发症息息相关。而辅助生殖技术助孕治疗的目的是单胎、足月、健康的婴儿出生。单胚胎移植是降低多胎妊娠风险的最有效方法。随着囊胚培养技术逐渐发展成熟和玻璃化冷冻技术的推进,通过培养囊胚和冻融胚胎移植,单胚胎移植临床妊娠率可提高到50-70%,同时显著降低多胎妊娠发生率。课题组之前的临床试验表明,对于预后良好的妇女,单囊胚移植冷冻周期比新鲜周期更能实现单胎活产。然而,冷冻单囊胚移植与子痫前期的高风险相关。子宫内膜准备是冷冻胚胎移植周期的一个重要方面。目前最常用的子宫内膜准备方法包括激素替代治疗周期和自然周期。围产期的并发症是否是由于冷冻周期中使用的内膜准备方案不同造成的,目前还不清楚。有研究表明,单胚胎移植和双胚胎移植的累积活产率无显著差别,但双胚胎移植的胚胎种植率低于单胚胎移植,考虑在胚胎着床时存在“胚胎竞争”的可能。如果双胚胎移植时,不仅增加了多胎率,同时降低了单个胚胎种植率,对胚胎的利用度造成损失,也会降低累积妊娠率。然而目前尚无有力的循证研究证据证实,单胚胎移植可提高胚胎种植率,提高单个胚胎的利用度。当患者有剩余的囊胚需要冷冻时,是单独冷冻保存,还是两个囊胚一起冷冻,不同组合的双囊胚移植是否对胚胎种植产生影响?这些问题都需要进一步研究去证实,以指导临床决策和胚胎实验室的冷冻策略。目前移植策略主要分为卵裂期胚胎移植或囊胚移植两种方式。卵裂期移植通常是指将受精后第2-3天的胚胎进行移植,适用于所有人群,单胚胎移植妊娠成功率大约为30%-35%左右。囊胚移植是通过胚胎在体外培养延长2-3天,只有高质量、具有植入潜力的胚胎才能进入囊胚阶段,与卵裂期胚胎移植相比,囊胚移植的妊娠率和分娩率显著提高。然而临床中通常移植2个卵裂期胚胎来提高妊娠率,但多胎风险也增加至20-30%。目前尚缺乏单胚胎移植累积活产率、孕期并发症及新生儿结局等方面高质量的研究数据。基于以上的思考,本论文将围绕辅助生殖技术中的临床热点问题——单胚胎移植进行系列研究,评估单囊胚冷冻移植周期中子宫内膜准备方案是否与产科及新生儿并发症的结局相关,再从胚胎种植率的角度对单囊胚移植和双囊胚移植进行比较,最后通过临床试验分析单囊胚移植与单卵裂期胚胎移植在累积活产率方面的差异,为进一步推进单胚胎移植策略提供依据。第一部分自然周期和激素替代周期对冻融单囊胚移植后孕产妇和新生儿并发症的影响研究目的:探讨在单囊胚玻璃化冷冻-解冻周期中应用自然周期、激素替代周期进行子宫内膜准备对母婴并发症的影响。研究方法:本研究为临床试验数据再分析,二次分析一项比较新鲜和冷冻单囊胚移植后活产率的多中心、随机、对照试验(Frefro-blastocyst)。该临床试验将月经正常的妇女随机分为新鲜胚胎移植组和冷冻胚胎移植组。冷冻组取卵后行全部囊胚予冷冻保存,并在随后的周期中进行单囊胚移植,内膜准备方案有自然周期和激素替代周期方案。在自然周期方案中,通过超声监测确定排卵日,在排卵后5天,移植一个冻融囊胚,从排卵日当天开始行黄体支持。在激素替代周期方案中,月经周期第1-3天开始口服戊酸雌二醇片,当子宫内膜厚度达到或超过7mm时,予孕激素进行内膜转化,孕酮启动后5天移植冻融囊胚。如果妊娠成功,黄体支持持续至妊娠10周后减量至停用。所有孕妇在分娩前后都进行了随访。结果:共有513例自然周期方案和287例激素替代周期方案不孕患者被纳入研究。孕产妇并发症、新生儿并发症及出生体重在自然周期和激素替代周期方案中未显示显著性差别。对混杂因素进行校正后,妊娠期糖尿病、妊娠期高血压病、子痫前期、早产、小于胎龄儿和大于胎龄儿等产科并发症的发生率在两种方案中差异仍不显著。自然周期方案的总活产率(59.45%vs.50.17%,P=0.001,校正优势比(AOR)1.366,95%可信区间(CI)0.975-1.913,校正后P=0.07),临床妊娠率(68.23%vs.58.89%,P=0.008,AOR 1.406,95%CI 0.992-1.991,校正后P=0.055)和持续妊娠率(62.18%vs.52.61%,P=0.008,AOR 1.387,95%CI 0.988-1.948,校正后P=0.059),均未显著高于激素替代周期方案。然而,与自然周期相比,激素替代周期与生化妊娠流产风险显著增高(6.86%vs.18.18%,P<0.001,AOR 0.328,95%CI,0.176-0.611,校正后 P<0.001)。结论:自然周期和激素替代周期两种方案在冷冻单囊胚移植中应用,对孕产妇和新生儿并发症发生率无显著性影响。但自然周期冷冻单囊胚移植可降低生化妊娠流产率。第二部分单囊胚是否比双囊胚移植提高胚胎种植率研究目的:从胚胎种植率的角度,探讨单囊胚移植与双囊胚移植对临床结局的影响,旨在为临床改善助孕结局并降低助孕风险提供更好参考,为进一步推进选择性单胚胎移植策略提供依据。研究方法:对2013年1月至2019年12月在温州医科大学附属第一医院生殖医学中心行冷冻囊胚移植的患者进行回顾性分析。本研究纳入标准:首次或第二次行胚胎移植,行常规体外受精(IVF)或卵胞浆内单精子注射(ICSI)治疗获得的胚胎,经玻璃化冷冻后的冻融囊胚移植周期。排除标准:子宫畸形(如纵膈子宫、单角子宫、双角子宫等)、严重的宫腔粘连、输卵管积水、反复种植失败、复发性流产者;同个周期同时移植卵裂期胚胎和囊胚者;囊胚复苏失败该周期取消者。共纳入研究分析5730例,其中单囊胚移植2262例,双囊胚移植3468例。通过比较单囊胚移植和双囊胚移植的种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、继续妊娠率、活产率、流产率、多胎妊娠率、早产率等临床结果,分析影响胚胎种植相关因素。再对临床中常用的五种移植策略进行分组:单优胚组、单非优胚胎组、双优胚组、优胚+非优胚组、双非优胚组。根据初步分析的结果对年龄<38岁、≥38岁和第5天(D5)、第6天(D6)冷冻日进行分层分析,主要研究指标:胚胎种植率。次要研究指标:活产率、多胎妊娠率。研究结果:(1)通过多因素logistic回归分析校正混杂因素后,双囊胚移植与生化妊娠率、临床妊娠率、继续妊娠率、活产率、多胎妊娠率、晚期流产率和早产率升高相关,与生化妊娠流产率和早期流产率降低相关。D6冷冻日、高龄均与生化妊娠率、临床妊娠率、继续妊娠率、活产率负相关,而有优质胚胎移植与之正相关,因此推测影响胚胎种植的因素包括移植个数、移植胚胎质量、年龄、胚胎冷冻日。(2)当D5囊胚移植时,对于年龄<38岁的女性而言,单优胚组的种植率为53.45%,显著高于单非优胚组(40.03%)、优胚+非优胚组(46.71%)和双非优胚组(42.22%)(P<0.01),且有高于双优胚组的趋势(50.46%)(P>0.01)。非优质胚胎无论双胚胎还是单胚胎移植,种植率无差异。活产率在各移植策略组中显示:双优胚组(56.64%)、优胚+非优胚组(55.33%)、双非优胚组(51.05%)>单优胚组(42.76%)>单非优胚(30.74%)。而多胎妊娠率在各移植策略组中显示:双优胚组(50.19%)>优胚+非优胚组(42.31%)、双非优胚组(37.04%)>单优胚组(1.48%)、单非优胚组(1.72%)。对于≥38岁的女性而言,单优胚组种植率为39.77%,显著高于优胚+非优胚组的种植率(21.25%)(P<0.01);单非优胚组种植率(25.58%)高于优胚+非优胚组的种植率(P>0.01);活产率各组间无显著性差异;多胎率在双优胚组最高57.69%,优胚+非优胚组为21.43%,双非优胚组为29.17%,而单胚胎组均无多胎发生。(3)当D6囊胚移植时,对于年龄<38岁的女性而言,单优胚组种植率与其余组无显著差异(P>0.01),单非优胚组种植率显著低于双优胚组、优胚+非优胚组(P<0.01),与双非优胚组无差别(P<0.01)。活产率在各移植策略组中显示:双优胚组(52.28%)>双非优胚组(34.33%)>单非优胚组(21.09%);优胚+非优胚组(43.03%)>单优胚组(28.04%)、单非优胚组。多胎妊娠率在各移植策略组中显示:双优胚组(37.29%)、优胚+非优胚组(33.33%)、双非优胚组(28.57%)>单优胚组(1.01%)、单非优胚组(0)。在≥38岁女性中,各组胚胎种植率、活产率、多胎妊娠率未显示出有统计学意义的差异。结论:为了提高活产率,同时有D5囊胚和D6囊胚时优先移植D5囊胚,同时有优质胚胎和非优质胚时,优先移植优质胚胎。为了提高胚胎利用度,降低多胎率,推荐单胚胎移植,尤其是有D5囊胚形成时,优质胚胎应单独移植,以提高胚胎着床率,避免对胚胎造成浪费。年龄≥38岁女性通过双胚胎移植并未获得比单胚胎移植更高的临床活产率,反而增加多胎妊娠风险,因此不推荐双囊胚移植。第三部分单囊胚移植与单卵裂期胚胎移植累积活产率比较研究目的:探讨单胚胎移植时囊胚移植和卵裂期胚胎移植对累积活产率的影响,指导临床更合理地利用胚胎,减少不良妊娠结局,达到理想的健康活产目的,为患者做出最佳的诊疗决策。研究方法:对2018年11月-2019年6月在山东大学附属生殖医院行IVF/ICSI的不孕女性,进行随机分组,分为卵裂期单胚胎移植组和囊胚期单胚胎移植组。纳入标准:年龄≥20岁,且≤40岁;拟行第1或第2周期IVF或ICSI;卵裂期可移植胚胎≥3枚。排除标准:宫腔形态异常、黏膜下子宫肌瘤或宫腔粘连;拟行未成熟卵母细胞体外培养、胚胎植入前遗传学诊断/筛查;B超下可见的输卵管积水;有复发性流产病史的患者;拟行全胚冷冻-冷冻移植;在在辅助生殖技术及妊娠的禁忌症、或患有对妊娠有明确影响的疾病。以首次活产为研究终点,鲜胚周期未活产则进入第一次冻胚移植,如未活产继续进入第二次冻胚移植,如未活产,继续进入第三次冻胚移植,直到胚胎移植完结束。通过比较两组连续1年内至少3次连续单胚胎移植后的累积活产率。研究结果:共有122例患者纳入了本研究,其中卵裂期组61例,囊胚期组61例。两组患者年龄、不孕年限、月经规律比例、继发性不孕比例、不孕原因、体重指数、窦卵泡数、基础内分泌、抗缪勒管激素均无显著性差异(P>0.05)。鲜胚周期中卵裂期组和囊胚期组在促排卵方案、促性腺激素用量、绒毛膜促性腺激素注射日黄体生成素、雌二醇、孕酮水平、获卵数、受精方式、双原核(2PN)受精数、2PN卵裂数、第3天(D3)可移植胚胎数、D3优质胚胎数、中重度卵巢过度刺激综合征发生率方面均无显著性差异。卵裂期组冷冻胚胎数(5.77±2.47)个,显著多于囊胚期组的冻胚数(3.66±2.37)个,差异有统计学意义(P<0.05)。卵裂期组新鲜胚胎移植49例,新鲜周期移植率80.33%,囊胚期组新鲜胚胎植44例,新鲜周期移植率72.13%,两组无明显差别。鲜胚移植日两组内膜厚度无显著差异。卵裂期组活产率42.86%(21/49),稍高于囊胚期组的活产率34.08%(15/44),但组间无统计学差异(P>0.05),两组均有一例双胎妊娠。两组在生化妊娠率、临床妊娠率、流产率、异位妊娠率方面无显著差别。除囊胚期组一例患者无可移植胚胎外,其余在新鲜周期未获得活产的患者,以及新鲜周期未移植的患者,均进行了第一次冷冻胚胎移植。卵裂期组共移植40例,囊胚期组共移植41例。两组患者内膜准备方案和移植前子宫内膜厚度无差异。生化妊娠率、临床妊娠率无显著性差别。活产率在囊胚组达到53.54%(22/41),高于在卵裂期组的37.50%(15/40),而差异仍无统计学意义(P>0.05)。第二次冻胚移植中卵裂期组和囊胚期组的活产率分别为21.05%(5/11)、33.33%(1/3),无显著性差异(P>0.05)。第三次冻胚移植周期中,卵裂期组11例,活产3例,活产率27.27%,囊胚期组3例,活产1例,活产率33.33%,两组仍未显示出差异。第四冻胚移植中,卵裂期组1例,获得继续妊娠,囊胚期组有2例,均已活产。通过意向性分析(ITT)数据集计算目前两组的累积活产率均为70.49%(43/61)。排除方案违背病例后的合格病例分析数据集(PP)显示,两组累计活产率分别为76.47%(39/51)、70.49%(43/61),未显示出明显差异。两组出生婴儿早产发生率、出生体重、剖宫产率及性别比例均为明显差别。结论:临床试验随机分组后的1年随访中,卵裂期和囊胚期单胚胎移植的累积活产率无显著性差别。