轮状病毒(Rotavirus,RV)是一种在世界范围内广泛流行的常见病毒,属于呼肠病毒科的一种,由分子量不一的11个双链RNA片段组成。根据RV基因结构及其特异性,可划分为A-G七个组。其中,病毒的血清型又由第4和第9基因片段编码的外衣壳蛋白VP4和VP7决定,分为P型和G型。RV可以在人类和动物中引起病毒性胃肠炎(亦称病毒感染性腹泻),A组RV主要引起婴幼儿腹泻,B组则主要感染成人,C组主要在猪群中流行,D-G组主要与动物疾病相关。据统计,世界上每年大约有200,000名儿童因感染RV所致的病毒性腹泻而死亡。背景:病毒受体是介导病毒感染宿主细胞的起始关键步骤,RV受体研究一直是RV研究领域的热点。既往研究表明一些动物RVs能够识别唾液酸(Sialic acid,SA)作为受体,但是后来又发现绝大多数的动物RVs和人类RVs是唾液酸不敏感型的,还有研究表明热休克蛋白70(Heat shock protein70,Hsp70)、神经节苷脂、整合素家族以及Toll样受体等与RV感染有关。人类血型组织抗原(Human histo-blood group antigens,HBGAs)是广泛分布在呼吸道、消化道、泌尿生殖道黏膜上皮细胞表面的一种非唾液酸化的糖缀合物,也能以游离的寡聚糖形式存在于唾液、肠液、乳汁和血液等体液中。HBGAs是在糖基转移酶的催化作用下,在前体糖链上逐步增添不同的单糖而形成的。在肠道上皮细胞上表现为ABH和Lewis抗原,对应在红细胞上表现为分泌型(A、B、O血型)和非分泌型。课题组经过近十余年来的志愿者攻毒实验、分子流行病学和分子生物学实验研究,证实肠道黏膜上的HBGAs是诺如病毒(Norovirus,NoV)的病毒受体,受此启发,课题组较早开展轮状病毒与HBGAs的相关性研究工作,通过表达RV的刺突蛋白VP8*开展VP8*-HBGAs相互作用研究,结果发现RVs的3个主要P基因型(P[Ⅱ]:P[4]、P[6]、P[8])能够结合1型H抗原和Leb,随后又研究发现了不同RVs基因型与HBGAs的多种结合模式:P[Ⅲ](P[9]、P[14]和P[25])均能识别A型HBGAs抗原,而P[Ⅳ](P[11])主要识别2型的HBGAs前体LacNAc。据此,我们有理由推测HBGAs对RVs的进化以及流行规律可能起到了选择性调控作用,即HBGAs影响了 RVs的进化过程。进一步深入研究RVs与HBGAs的相互作用将有助于了解RVs的宿主适应特性及病毒进化和流行规律,有助于制定合理的抗RVs疫苗策略和抗病毒药物开发。中医药的理论与实践证明中医药治疗病毒性腹泻具有广阔的应用前景和很好的开发价值。课题组前期在开展靶向阻断NoV结合HBGAs受体的中药活性成分筛选研究中,发现“涩肠止泻”中药五倍子和石榴皮具有显著阻断NoV衣壳蛋白结合HBGAs受体的作用。基于RVs VP8*-HBGAs受体结合/阻断作用模型理论上可用于体外抗RVs药物筛选,然而,具有阻断NoV衣壳蛋白结合HBGAs受体作用的石榴皮等中药是否亦具有较好的阻断RVs结合HBGAs受体作用尚有待于进一步评价。方法:在前期研究RVA P[Ⅱ]、P[Ⅲ]和P[Ⅳ]基因组毒株与HBGAs结合方式的基础上,重点以RVA P[Ⅰ]基因组和RVC毒株为研究对象,Genebank中检索RVA/RVC的VP4序列并下载,用Laser Gene/Edit sequence软件编辑并截取VP4中的VP8*序列(aa46-231),通过序列比对和构建基因进化树,确认毒株的基因组和基因型别分类。克隆表达代表性毒株(RVA:P[3]、P[5]、P[6]、P[7]、P[15]、P[16]/EDIM、P[16]/EMcN、P[23]、P[28]和 RVC:RVC/牛源 BAM7272.1、RVC/人源BAB83827.1)的RV GST-VP8*蛋白,基于VP8*-HBGAs作用模型,主要运用糖基配体筛选实验和唾液HBGAs结合ELISA实验,确定RVA P[Ⅰ]和RVC结合HBGAs不同糖类抗原的类型。结合前期工作,深入分析总结RVs的HBGAs结合谱与其感染宿主的相互关联性和规律,明确HBGAs对于RVs宿主范围和进化机制的调控作用。基于建立的RV VP8*-HBGAs结合作用模型,以中药作为干预对象,评价RV VP8*-HBGAs结合/阻断作用模型作为体外抗RV药物筛选的可行性,重点评价石榴皮水提液对RV VP8*结合HBGAs(A/B/O)的阻断作用,并在细胞水平综合运用病毒空斑抑制实验方法、CPE观察法和免疫荧光法进一步验证石榴皮的抗病毒作用。病毒空斑抑制实验方法:6孔(或12孔)培养板中常规培养MA104细胞,将2倍梯度系列稀释的石榴皮水提液与RV Wa病毒(50-100PFU)在37℃条件下孵育1h后感染MA104细胞1h后弃去,覆盖0.6%低熔点琼脂糖的半固体细胞培养基。37℃培养4天,4%多聚甲醛溶液固定,0.1%结晶紫溶液染色,通过观察计算对照组及药物处理组空斑数,计算空斑抑制率(IR)。细胞病变CPE在倒置显微镜下观察细胞形态,免疫荧光法观察RV Wa病毒在MA104细胞中的复制水平。结果:1.48条RVA的基因进化树被分为P[Ⅰ]-P[V]五个基因组,38个P基因型。P[Ⅰ]基因组含有最多的25个P基因型,P[36]、P[37]和P[38]是新增的三个P基因型,其中P[36]和P[37]属于P[Ⅰ]基因组,P[38]则属于P[V]基因组。32条RVC的基因进化树聚合成了几个分支,分别为猪、牛、狗以及人类基因组。RVC和RVA的VP8*进化树在结构上相互分离。2.成功构建了十一株 RV(RVA:P[3]、P[5]、P[6]、P[7]、P[15]、P[16]/EDIM、P[16]/EMcN、P[23]、P[28]和 RVC:RVC/牛源 BAM7272.1、RVC/人源 BAB83827.1)的VP8*表达质粒并表达RV GST-VP8*蛋白,经SDS电泳鉴定,所得蛋白大小与预期相符。3.以表达的十种RV GST-VP8*融合蛋白(分别稀释成5μg/ml和50μg/ml)作为探针,使之与包含约有600种聚糖的糖芯片进行反应。特定RV GST-VP8*蛋白与糖基相互作用的活性用相对荧光单位RFU来表示。用荧光标记的抗GST标签的RV单克隆抗体作为检测抗体,通过微阵列扫描仪测量荧光并进行定量,结果显示:RVA P[Ⅰ]基因组的 P[3]、P[5]、P[6]、P[7]、P[28]、P[16]/EDIM、P[16]/EMcN以及RVC中的牛源毒株都能够识别含有Gala1-3Galb1-4Glc的糖类结构。其中,P[3]、P[16]/EDIM、P[16]/EMcN及牛源RVC毒株与αGal糖类的结合能力最强,处于糖类结合能力图谱的第一位,而P[5]、P[6]、P[7]、P[28]与之结合能力则相对较弱。P[28]除了与αGal结合,还能与Fucα1-2Galb1-3GlcNAc结构的糖类相结合(处于与P[28]结合能力图谱的第一位),证明P[28]能够识别1型的HBGAs-H抗原。P[3]、P[7]、P[15]、P[23]可以结合一种含有Neu5Aca2-3Ga1b1-4G1cNAC结构的糖类(包含唾液酸糖类结构),证明P[3]、P[7]、P[15]、P[23]可以识别唾液酸类受体。人源RVC毒株能够识别结合Ga1NAcα1-3(Fucα1-2)Ga1b1-3G1cNAc的糖类,即能够识别结合HBGAs-A型抗原。以表达的十种RV GST-VP8*融合蛋白开展基于唾液和动物黏蛋白的VP8*HBGAs结合实验,结果发现:人源RVC与人类A型唾液显示出了一种非常明显的结合模式(30%),而动物RVs与人类唾液的结合能力普遍较低(0-8%),C组的人/牛株RVs与猪/牛黏蛋白都能结合,提示不同种类动物与人类之间的宿主范围存在种群隔离屏障。4.根据特定基因型别RV GST-VP8*蛋白与糖基的作用特征,进一步进行结合αGa1糖类的RVs基因进化树分析发现:与αGal的结合能力较强的P[3]、P[16]、RVC/牛以及P[5]的感染宿主类型分别为猴子、鼠和牛,都属于较为低等的生物,与αGa1的结合能力较弱的P[28]的宿主类型主要为人类,这四种毒株与αGa1结合能力的强弱顺序正好对应了他们感染宿主的进化等级高低。与A型HBGAs结合的RVA与RVC VP8*序列保守性分析发现:两个基因组RVA/RVC结合A型抗原的结合位点在各个基因组内都高度保守,但RVA和RVC两组之间的A抗原结合位点则存在差异(RVA:101 R,187S,188Y,189Y,190L,191T;RVC:109R,110A,152G,205P,206R,207S)。5.石榴皮经常规水煎3次后,所得水煎液经75℃恒温水浴浓缩,制成初始剂量1mg/ml水剂,0.22μm孔径微孔滤膜过滤后用于抗病毒效果评价。结果表明:石榴皮水提液能够显著阻断RVAP[28]VP8*蛋白与A、B、O型唾液结合,BT50浓度为1.2μg/ml。进一步在细胞水平验证石榴皮水提液的抗病毒效果,结果发现:10μg/ml的石榴皮水提液即具有明显的直接杀病毒作用和抗病毒效果。即10μg/ml的石榴皮水提液即能明显改善病毒导致的细胞病变(CPE)和病毒空斑形成(plaque assay),免疫荧光法观察到经石榴皮水提液干预的RV Wa病毒在MA104细胞中的复制水平明显降低。结论:1.通过分析比较不同基因组RVA/RVC的HBGAs的结合特征与宿主类型的关联,发现不同基因型RVs的流行病学表现与HBGAs的结合谱是匹配的,表明HBGAs的受体选择作用能够调控RVs的进化以及感染的宿主类型,掌握HBGAs对RVs的选择作用将有助于深入了解RVs的宿主适应性以及流行规律,为制定RVs疫苗的新策略以及寻找开发新的抗RVs药物具有深远意义。2.RV VP8*-HBGAs受体结合/阻断作用模型是一种新型有效的体外筛选抗RV药物模型。石榴皮水提液能明显阻断RV VP8*结合HBGAs(A/B/O)受体,在细胞水平证实具有较好的抗病毒效果。阻断受体结合作用可能是石榴皮等中药具有“涩肠止泻”特性的重要机制。