1研究背景动脉粥样硬化疾病(atherosclerosis,AS)是一种动脉管壁的进展性炎症疾病,在引起急性心脑血管疾病例如心肌梗死和中风之前可以很多年都没有临床症状。在AS的发展过程中,伴随内皮细胞损伤,脂肪和胆固醇逐渐沉积在动脉管壁上,形成AS脂核,在脂核之外,覆盖着一层由平滑肌细胞(SMC)、成纤维细胞和胶原组织等形成的纤维帽。AS斑块中还有巨噬细胞、T细胞和中性粒细胞等炎性细胞的浸润。当纤维帽中的SMC减少、细胞外基质合成减少或降解增多时,斑块纤维帽变薄,导致斑块不稳定和斑块破裂,引发急性冠脉事件。因此寻找增加斑块稳定性的方法和药物具有重要的临床意义。目前,在干细胞与AS领域的研究表明,间充质干细胞(MSC)可以迁移到损伤组织,分化为功能细胞并且修复受损的组织。移植的MSC可以定位到破裂的斑块区域,分化成为内皮细胞并分泌胶原纤维。此外,骨髓、血液循环以及动脉外膜中的平滑肌祖细胞都可以分化为SMC并迁移到损伤区域;在某些条件下,外膜中的胚胎成纤维细胞也可以向内膜迁移并分化为SMC。干细胞抗原1(Stem cell antigen 1,Sca1)是外膜平滑肌祖细胞的常见标志物,由于外膜中的Sca1+血管祖细胞和胚胎成纤维细胞更靠近AS的损伤内膜并且来源更加广泛,因此如何有序调控Sca1细胞和胚胎成纤维细胞向SMC的精准分化变得更加重要。大量研究表明,DKK3对于胚胎组织的生长发育不可缺少,例如神经管上皮、胚芽和骨组织,另外DKK3可以抑制多种类型的细胞肿瘤,过表达时可以抑制细胞的增殖;目前,有研究指出DKK3能够影响上皮-间充质的转化,促进部分诱导的多能干细胞(partially induced pluripotent stem cell)向平滑肌细胞分化。因此DKK3可能是一种合适的干细胞诱导因子,深入研究DKK3诱导调控外膜Sca1+血管祖细胞和胚胎成纤维细胞向SMC分化影响斑块稳定性的机制具有十分重要的临床意义。2研究目的我们的研究目的包括:(1)研究DKK3对于胚胎成纤维细胞和Sca1+细胞诱导分化的促进作用及其分子机制;(2)研究两种分化而来的SMC对于DKK3-/-ApoE-/-小鼠串联狭窄手术引起的动脉粥样硬化病变的作用,探讨DKK3对于AS斑块炎症、平滑肌细胞数量以及细胞外基质含量的影响;(3)研究DKK3对于家兔动脉粥样硬化斑块的影响;(4)在临床患者中研究DKK3与动脉粥样硬化斑块稳定性的关系。3研究方法1.小鼠串联狭窄病变模型将 8 周龄 DKK3-/-/ApoE-/-和 DKK3+/+/ApoE-/-小鼠(C57BL/6J 背景)高脂喂养6周然后进行手术。麻醉后分离右侧颈总动脉,分别在距离颈动脉分叉处1mm的远端和距离远端狭窄3mm的近端制作一个外径为150μm的串联狭窄。继续饲养4周造成动脉粥样硬化模型。2.血管外膜细胞孵育将总量为1×106来源于GFP转基因小鼠的Sca-1+祖细胞与25μL的Matrigel(?)基底膜混合,然后接种于接受串联狭窄手术小鼠的颈动脉外膜中。4周后取材进行后续实验。3.DKK3凝胶释放实验在DKK3释放实验中,将重组的DKK3(200ng/mL)与30%的Pluronic 127凝胶混合,然后外敷于接受串联狭窄手术的小鼠的颈动脉外膜上将血管包住。4周后取材进行后续实验。4.静脉移植实验选取3月龄DKK3-/-/ApoE-/-和DKK3+/+/ApoE-/-小鼠,麻醉后将右侧颈总动脉游离,切去一段动脉,取一段同窝异体小鼠的腔静脉用8.0丝线与两个动脉断端吻合。观察到移植静脉有搏动证明移植成功。5.股动脉损伤和细胞孵育实验DKK3+/+/APoE-/-小鼠麻醉后分离双侧股动脉,来回插入0.25mm导丝三次造成动脉损伤,长度为从股动脉到远端肌肉分支4mm。右侧损伤股动脉外膜注入25μL的Matrigel?人工基底膜,其中包含源自SM22-Lacz小鼠的Sca-1+细胞和胚胎成纤维细胞(1×106),另一端作为对照,72小时后取材。6.体内基质胶栓实验在严重免疫缺陷小鼠背部和腰间皮下注射50μL混有HUVECs的基质胶,实验组胶内加入标记有Qtracker?605的胚胎成纤维细胞分化的SMC,对照组胶内加入未诱导的胚胎成纤维细胞。每组小鼠各选择六个注射点。12天后处死小鼠并将栓子取出,一部分迅速投入液氮,进行后续的冰冻切片实验;另一部分用4%福尔马林溶液浸泡过夜后进行组织学染色。7.组织学染色石蜡切片或冰冻切片用H&E染色观察形态,免疫组织化学染色检查RAM-11、α-SMA、MMP-9,免疫荧光检测 SM22、SMMHC、SMA、CD68,Collal、DKK3、elastin、CD31、CD144、Calponin、Sca1,天狼猩红染色检查弹力纤维和胶原。8.β-半乳糖苷酶原位染色取5mm经过损伤手术的股动脉,剥去脂肪组织和血管外膜后沿长轴纵切,用β-半乳糖苷酶染色固定液固定组织,加入染色工作液,37℃孵育直至部分细胞颜色变蓝。然后在普通光学显微镜下观察、拍照。9.细胞培养人类胚胎成纤维细胞购自ATCC,用F-12K培养基(ATCC,30-2004)培养。每两天更换一次培养基,每三天按照1:3或者1:7的比例传代。小鼠Sca-1+祖细胞和胚胎成纤维细胞分离自不同小鼠的主动脉内膜,包括ApoE-/-小鼠、野生型小鼠以及转基因小鼠(GFP-Sca-1;SM22-LacZ),然后用抗Sca-1磁珠试剂盒纯化细胞。纯化后细胞用含10%的EmbryoMax?内皮细胞级的高品质胎牛血清的DMEM培养基培养,培养基中加入10ng/ml的白血病抑制因子和0.1mM的2-巯基乙醇,培养皿同样预先包被0.4%的明胶。分离Sca-1+细胞后,剩余细胞用胚胎成纤维细胞培养基继续培养,传代5次后即为纯化的胚胎成纤维细胞。10.细胞转染和药物刺激人类胚胎成纤维细胞和Sca1+细胞加入过表达腺病毒,24小时后换液,继续加入指定药物刺激,培养至指定时间收取细胞;人类胚胎成纤维细胞和Sca1+细胞加入沉默慢病毒和polybrene,24小时后换液,继续加入指定药物刺激,培养至指定时间收取细胞。11.胚胎成纤维细胞核转染ATF6用NHDF核转染试剂盒对人胚胎成纤维细胞进行电穿孔转染ATF6转录因子质粒,对照组用PCMV5空载体。将2×106个细胞和2μg的空载体或ATF6质粒共培养,然后接种于包被明胶的培养板上,在DM培养基中分化48小时,收集细胞进行Q-PCR实验。12.RNA提取、反转录和Q-PCR按照说明书用RNA提取试剂盒提取总RNA,用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,然后进行Q-PCR。13.免疫印迹将20-50μg总蛋白与1×的SDS上样缓冲液煮沸10分钟,根据蛋白分子量的不同选择4%-12%的Bis-Tris胶,然后用90V电压电泳分离蛋白,200mA电流转膜2小时将胶上蛋白转至PVDF膜上,然后用TBST配制的5%牛奶室温下封闭1小时,用相应一抗孵育过夜。第二天用相应辣根过氧化物酶标记的二抗孵育PVDF膜,室温下孵育2小时,然后用ECL化学发光法检测蛋白。14.细胞免疫荧光细胞首先用4%多聚甲醛固定,然后在室温下用5%猪血清封闭30分钟。用相应一抗孵育过夜。第二天用相应的荧光二抗37℃下孵育30分钟,用DAPI染核,用荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察。15.酶联免疫吸附试验(ELISA)血清或培养基按照说明书进行稀释后按照步骤进行操作,检测血清和培养基中DKK3浓度,培养基中的胶原1a1和TGFβ1的浓度。16.荧光素酶活性分析在进行胚胎成纤维细胞实验时,预先在12孔板中包被明胶,转染DKK3过表达病毒,24小时后用myocardin或SMMHC启动子报告载体转染细胞,对照组加入pGL3-Luc-Renilla。转染48小时后用多功能酶标仪检测荧光素酶和光素酶活性。相对荧光素酶单位(Relative Luciferase Unit,RLU)定义为荧光素酶与光素酶的比值,空白对照组设置为1.0。17.家兔实验20只体重在1.5-2.0 kg,年龄在8-10周的新西兰大白兔随机分为2组,每组10只。首先耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉家兔,利多卡因局部麻醉后暴露右侧股动脉,用小剪刀剪一个小口,插入针鞘,将导丝从针鞘插入直到胸主动脉,取一个4-Fr球囊导管(3.5×15 mm2)沿导丝进入股动脉,进入足够深度后用肝素盐水充盈球囊,加压至8个大气压力,然后将球囊导管回抽至腹主动脉分叉处,释放球囊内压力并再次插入到胸主动脉处,反复进入回抽三次造成动脉内膜损伤。术后家兔继续用含1%胆固醇和3%猪油的饲料喂养12周。从第12周开始,每两周通过耳缘静脉注射一次腺病毒,病毒量为2.5×109pfu,实验组注射DKK3过表达病毒,对照组注射相同量的腺病毒空载体,从第13周开始,每两周耳中动脉取血一次,第20周处死家兔,取整段主动脉进行后续实验。18.主动脉油红O染色分离整段主动脉,剥离血管外膜和脂肪组织,纵切,暴露血管内膜,拍照后用油红O染液浸泡2-4小时然后用70%酒精脱色直到仅内膜中的脂肪组织着色。然后用蒸馏水冲洗,置于4%福尔马林溶液中保存。将染色后的整段血管展开后拍照分析。19.血脂检测小鼠处死时心脏取血0.5-1.0mL,室温下静置1小时直至血液凝结,然后以2000 g/min的速度离心15分钟。家兔造模后分别在第12、13、14、15、17、20周取血,用全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的含量。20.临床患者检测收集山东大学齐鲁医院从2015年6月至2015年]2月的病例,根据患者的病史和临床症状按照Braunwald分类法分为稳定性心绞痛组和不稳定性心绞痛组。记录入组患者的一般临床指标,包括身高、体重、年龄、性别、血压、血糖、每日吸烟和饮酒量。入组患者在用药前进行一次静脉采血,化验室检测其血清中白细胞、肌酐、纤维蛋白原、同型半胱氨酸、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白,用ELISA试剂盒检测血清中DKK3含量。4研究结果1.DKK3敲除改变动脉粥样硬化斑块成分利用串联狭窄手术构建小鼠动脉粥样硬化模型,4周后进行HE染色可见DKK3-/-ApoE—/-双敲小鼠斑块内出血多于DKK3+/+ApoE-/-小鼠,而斑块中SMC含量和细胞外基质含量少于DKK3+/+ApoE-_-小鼠,巨噬细胞浸润多于DKK3+/+ApoE-/-小鼠,天狼猩红染色显示DKK3-/-ApoE-/-双敲小鼠弹力纤维和胶原表达减少。2.DKK敲除增加移植血管破裂发生率构建小鼠颈动脉移植模型,在DKK3-/-ApoE-/-双敲小鼠组,十只小鼠全部发生了移植血管破裂并发症,可见破裂、坏死、钙化和红细胞聚集,而DKK3+/+ApoE-/-小鼠组仅有2只发生移植血管破裂并发症。检测斑块内成分发现DKK3-/-ApoE-/-双敲小鼠斑块内SMC减少而CD68+巨噬细胞增多,而弹力纤维和胶原含量减少。3.DKK3促进Sca1+细胞迁移对小鼠进行串联狭窄手术,取带有GFP标记的转基因小鼠的原代Sca1+细胞,注射到手术后的颈动脉外膜中,结果发现Sca1+细胞在4周内迁移到DKK3+/+ApoE-/-小鼠内膜,并部分分化为SMC,而Sca1+细胞在DKK3-_-ApoE-_-双敲小鼠血管外膜中的迁移能力降低。此外,Sca1+细胞减少了 DKK3+/+ApoE-_-小鼠斑块内出血的发生率。4.Sca1+细胞和胚胎成纤维细胞促进内膜损伤修复对DKK3+/+ApoE-/-小鼠进行股动脉损伤手术,将来自SM22-Lacz小鼠和野生型小鼠的Sca1+细胞和胚胎成纤维细胞注射至其血管外膜,3天后可见细胞迁移至内膜并分化为SMC。5.DKK3在体外可以诱导胚胎成纤维细胞分化为SMCDKK3可以促进胚胎成纤维细胞在DM分化培养基中的分化,4天后形态上即逐渐向SMC转化,在基因水平和蛋白水平上都表达SMC的特异分子,并且可见SMMHC和myocadin的启动子活性明显增加。6.DKK3诱导胚胎成纤维细胞向SMC的分化受TGF-β1调节在DKK3过表达和仅有空载体处理的胚胎成纤维细胞中添加人的重组TGF-β]因子。结果同时添加DKK3过表达病毒和TGF-β1重组蛋白的胚胎成纤维细胞形态与未处理的胚胎成纤维细胞和仅添加TGF-β1因子的成纤维细胞明显不同,前者形态更趋向于平滑肌。PCR和免疫印迹显示TGF-β]刺激可以进一步增加过表达DKK3的胚胎成纤维细胞表达SMC特异分子和细胞外基质。在DKK3过表达的胚胎成纤维细胞中添加TGF-β1受体ALK5的特异性抑制剂,结果显示,ALK5受抑制后,SMC特异蛋白的表达显著下降。同样,向培养基中添加抑制活化TGF-β1的特异性中和抗体也可以抑制SMC标志物的表达。向添加TGF-β1细胞因子的胚胎成纤维细胞的培养基中加入含或不含DKK3沉默(shDKK3)的慢病毒。结果显示,DKK3沉默后,SMC特异蛋白和细胞外基质明显减少。用慢病毒外源性沉默TGF-β1的表达也可以减少SMC特异蛋白和细胞外基质的分泌,这表明SMC的分化进程受到了抑制。7.DKK3通过激活ATF6调节TGF-β1的表达通过Qiagen Champion芯片转录因子搜索发现当DKK3过表达时转录激活因子6(ATF6)上调。为了验证DKK3是否能够诱导ATF6的表达,我们对胚胎成纤维细胞感染了 shDKK3或者空病毒载体,结果发现DKK3沉默时,ATF6表达也下降,同时,用小干扰RNA沉默ATF6也可以导致TGF-β1在基因水平和蛋白水平的减少,相反ATF6过表达则不仅可以增加TGF-β1的表达还能增加SMC各种特异蛋白和细胞外基质的表达。8.DKK3诱导胚胎成纤维细胞分化为有功能的SMC我们还采用基质胶栓注射的实验来研究诱导的SMC与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)混合时在体内形成功能血管的能力。DKK3诱导的SMC添加了红色追踪标签然后在人工基底膜中与HUVEC混合,混合后注入重症综合性免疫缺陷(SCID)小鼠皮下。两周后收取标本并进行H&E染色。结果显示这些细胞可以形成完整的血管。冰冻切片免疫荧光染色检测内皮细胞标志物,结果显示内皮细胞形成了组成血管内衬的管状结构,而诱导分化的SMC正确定位到了外层,包裹住内层的内皮小管,形成了两层坚固的血管层。因此我们推断由DKK3诱导分化而来的平滑肌具有形成体内完整血管的功能。9.DKK3促进Sca1+祖细胞分化为SMCSca1+细胞接种于预先铺有胶原IV基质的培养皿中并且用DM分化培养基培养。PCR和免疫印迹结果显示SMC特异蛋白和DKK3表达量都上升。ELISA检测细胞培养基显示Sca1+细胞向SMC的分化过程中DKK3表达量升高。免疫荧光染色显示SMC的特异蛋白和DKK3表达都增多。用shDKK3沉默DKK3可以看到SMC特异蛋白减少,用DKK3抗体中和分泌型DKK3也可以得到相同结果。用重组DKK3蛋白或者过表达DKK3刺激细胞进行研究,结果表明SMC特异蛋白增多。10.DKK3通过调节Wnt通路促进Sca1+祖细胞分化用DKK3的抗体中和了 Sca1+细胞培养基中的DKK3因子,可以看到Wnt通路的靶基因下调,用shDKK3沉默DKK3也可以得到相似的结果。我们用反转录实时定量PCR分析器分析小鼠的Wnt通路。当DKK3过表达时,大部分与Wnt通路相关的基因表达明显增加;相反,加入shDKK3时,大部分Wnt通路基因表达下降。用Wnt通路的特异性抑制剂可以发现Wnt通路受到抑制后Sca1+细胞分化过程中SMC特异蛋白表达减少。免疫印迹分析表明过表达DKK3导致小鼠Sca1+细胞中活化状态的β-catenin增加,然而用特异性抑制剂抑制Wnt通路后,即使过表达DKK3,SMC标志物也会减少。综上所述,DKK3可以通过激活Wnt通路使Sca1+细胞分化为SMC。11.外源性DKK3可以减轻DKK3-/-ApoE-/小鼠动脉粥样硬化斑块形成对DKK3-/-ApoE-/-小鼠进行串联狭窄手术,然后在其颈动脉外膜敷上含有200μg/ml重组DKK3的pluronic凝胶。对照组采用DKK3+/+ApoE-_-小鼠,其颈动脉外膜测的pluronic凝胶中含有200μg/ml的小鼠血清蛋白。手术4周后取材切片进行H&E染色。结果显示,凝胶中DKK3蛋白的释放能够极大减少DKK3-/-ApoE-/-小鼠斑块中的红细胞数量。免疫荧光染色结果显示凝胶释放DKK3可以增加DKK3-/-ApoE-/-小鼠斑块中SMC的含量,减少CD68巨噬细胞的浸润,与DKK3+/+ApoE-/-小鼠没有明显差异。天狼猩红染色显示两组小鼠的细胞外基质含量也没有明显差异。因此这些结果表明外源性给予DKK3同样能够减少斑块内出血和巨噬细胞浸润、增加SMC和细胞外基质含量,从而改变斑块成分。12.DKK3过表达可以改变家兔动脉粥样硬化斑块的成分通过球囊拉伤加高脂喂养的方法构建家兔晚期动脉粥样硬化斑块模型。喂养10周后,通过耳缘静脉注射腺病毒的方法使家兔过表达DKK3。血清ELISA检测显示注射后DKK3持续升高。免疫组化检测结果显示DKK3腺病毒注射组斑块中SMC含量明显高于空载体注射组,而巨噬细胞浸润明显少于空载体注射组,而且MMP9+细胞少于空载体注射组。天狼猩红染色结果显示DKK3腺病毒注射组ECM含量高于空载体注射组。油红O染色结果显示两组斑块大小没有明显差别。13.不稳定心绞痛患者血清中DKK3含量降低分别收集稳定性心绞痛患者和不稳定性心绞痛患者血清。用ELISA的方法检测其血清中DKK3含量,结果显示不稳定性心绞痛患者血清DKK3水平降低。5研究结论1.我们首次证明了 DKK3是一种强有力的SMC分化诱导因子,在胚胎成纤维细胞中,DKK3可能通过与某种受体结合来激活ATF6进而激活TGF-β1,导致胚胎成纤维细胞分化为平滑肌细胞。2.在Sca1+血管祖细胞中,DKK3通过间接结合到Wnt结合位点ATF6,然后激活Wnt/β-catenin通路导致Sca1+血管祖细胞分化为平滑肌细胞。3.DKK3通过其诱导分化功能增加小鼠和家兔动脉粥样硬化易损斑块内平滑肌细胞和胶原纤维、弹力纤维含量,减少巨噬细胞浸润和斑块内出血的发生率,具有重要的治疗作用。4.不稳定心绞痛患者血清DKK3浓度下降,提示DKK3可能可以作为分子标志物预测不稳定心绞痛的发生。1.研究背景心肌纤维化是指心脏组织中胶原异常增殖、不同类型的胶原构成比例失调、排列紊乱。任何能够增加心脏后负荷以及影响神经-体液的因素都可能导致心脏肥大和心肌纤维化,表现为室壁僵硬、收缩能力和灌注下降。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活是导致心肌纤维化的最重要原因。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)AngⅡ是RAAS系统中最重要的组分,可以直接影响心肌细胞和成纤维细胞,导致心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖、过度分泌细胞外基质。因此,阻断AngⅡ的生物学效应必将对损伤的心肌产生保护作用。研究发现血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)可以裂解血管紧张素Ⅱ并且形成血管紧张素1-7(Ang1-7),后者对于心肌肥厚和纤维化具有一定的保护作用,显示出ACE2潜在的治疗价值。同时,近年研究发现,金属蛋白酶 17(A disintegrin and metalloproteinase 17,AD AM1 7)具有降解 ACE2的功能,因此我们推测其可能与血管紧张素Ⅱ导致的心肌损伤存在相关性。β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt通路的核心效应分子,当其在细胞质中增多时引起细胞核转位增多,进而引起促心肌肥厚和纤维化相关基因转录增多,导致心肌纤维化和心肌肥厚。糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一种抗心肌肥厚激酶,游离状态的GSK-3β可以被招募到卷曲蛋白受体(Frizzled receptor)上,从而与β-catenin结合,促进β-catenin的降解,阻断其核转录。转化生长因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)的生物学功能非常广泛,主要包括诱导内皮细胞合成功能、促进成纤维细胞合成胶原、抑制基质金属蛋白酶活性等。在心肌纤维化的过程中,TGF-β1不仅调节各种信号转导途径,还可以直接刺激CF细胞增殖,是导致心肌纤维化最重要的调节因子。因此,在本实验中我们检测了 TGF-β1在AngⅡ诱导的心肌纤维化中的作用。目前,已有研究报道dickkopf-3(DKK3)对于心肌具有一定保护作用,而其在AngⅡ诱导的心肌纤维化中的作用尚不清楚,对心肌组织中GSK-3β/β-catenin信号通路和ADAM17/ACE2的表达变化也没有研究,对此我们进行了本次研究。此外我们还研究了 DKK3是否影响TGF-β1/Smad3信号通路进而调节AngⅡ的致纤维化作用。2.研究目的本研究的目的主要有四个:(1)研究DKK3过表达是否减轻AngⅡ诱导的心肌肥厚和纤维化;(2)在AngⅡ诱导的心肌纤维化小鼠模型中,研究DKK3是否能够影响GSK-3β/β-catenin信号通路;(3)研究DKK3与ADAM17/ACE2和TGF-β1信号通路的关系;(4)研究DKK3对AngⅡ诱导的炎症和成纤维细胞增殖的作用。3.研究方法1.小鼠原代心脏成纤维细胞培养无菌条件下取新生C57BL/6小鼠的心脏,在培养基中剪碎后用Ⅱ型胶原酶消化三小时。离心后用完全培养基重悬沉淀,置于培养箱培养。2小时后换液去除未贴壁杂质,然后继续培养纯化成纤维细胞以备后续实验。2.细胞转染和药物刺激过表达实验首先将DKK3过表达病毒或者空载体按MOI=100加入成纤维细胞中,24小时后换液,加入1μg/ml的血管紧张素Ⅱ,共培养48小时后进行后续实验。分组如下:OV+AngⅡ组:DKK3过表达病毒+血管紧张素Ⅱ;AD+AngⅡ组:空载体病毒+血管紧张素Ⅱ;AngⅡ组:仅加血管紧张素Ⅱ;OV组:仅加DKK3过表达病毒;AD组:仅加空载体病毒;NC组:空白对照。3.细胞抑制实验原代心脏成纤维细胞接种后生长至30%然后进行刺激。将DKK3的小干扰RNA及对照RNA与载体混合后加入培养基,4小时后换液,24小时后加入1μg/ml的血管紧张素Ⅱ,再培养48小时,提取蛋白进行下一步实验。共分为四组:组1(NC-siRNA):仅添加阴性小干扰RNA;组2(NC-siRNA+Angll):加入阴性小干扰 RNA 和 AngⅡ;组 3(DKK3-siRNA+Angll):加入 DKK3 小干扰 RNA 和 AngⅡ;组 4(DKK3-siRNA):仅加入 DKK3 小干扰 RNA。4.动物实验取60只10到12周龄的野生型C57BL/6小鼠,随机分为4组,用微量泵以1000 ng/kg/min的速度缓慢泵入血管紧张素Ⅱ或生理盐水,持续28天,埋泵前三天尾静脉注射DKK3过表达腺病毒或空白病毒载体(2×109pfu),在第15天注射第二次病毒,第31天测量血压并处死小鼠。动物实验分组如下:组1(OV+AngⅡ):注射DKK3过表达病毒+泵入血管紧张素Ⅱ;组2(AD+Angll):注射空病毒载体+泵入血管紧张素Ⅱ;组3(OV):注射DKK3过表达病毒+泵生理盐水;组4(AD):注射空病毒载体+泵生理盐水。5.实时定量RT-PCR使用TRlzol试剂提取小鼠左心室的总RNA,然后用PCR热循环仪进行实时定量PCR,检测心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和β肌球蛋白重链(beta-myosin heavy chain,β-MHC)。具体参数为 95℃ 运行 30 s 然后 95℃ 运行 5 s共40个循环,最后56℃运行10 s。GAPDH用作内参,实验结果采用2△△CT进行计算。6.免疫印迹(Western blot)分析使用相应的蛋白提取试剂盒提取小鼠左心室或原代心肌成纤维细胞的总蛋白和核蛋白。各组调整相同蛋白上样量,电泳分离不同分子量蛋白,然后转至PVDF膜上。4℃条件下孵育相应的抗体过夜。所用一抗包括兔抗DKK3抗体、兔抗胶原Ⅰ、胶原Ⅲ抗体,兔抗磷酸化ADAM 17(T735)抗体,兔抗ACE2抗体、兔抗TGF-β1抗体、兔抗ADAM17抗体、兔抗GSK-3β抗体、兔抗磷酸化GSK-3β(Ser9)抗体、兔抗 β-catenin 抗体,兔抗活化 β-catenin(Ser33/37/Thr41)抗体、兔抗Bcl-2抗体、兔抗Bax抗体、兔抗Smad3、磷酸化Smad3(Ser423/425)抗体以及小鼠抗β-actin抗体,第二天孵育相应二抗后用化学发光法检测蛋白表达。7.细胞增殖分析(EDU)采用EDU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)染色的方法检测细胞增殖。在染色前进行细胞爬片并加入相应的药物刺激,然后加入含FBS和EDU的染料,多聚甲醛固定后用Triton X-100进行细胞通透,加入甘氨酸中和多聚甲醛;用Apollo-Fluor覆盖细胞并在室温下避光孵育、Hoechst33342染色后避光拍照,统计阳性细胞的百分比。8.免疫荧光CFs细胞用4%多聚甲醛固定后用山羊血清封闭,用Triton X-100进行细胞通透,加入兔抗active-β-catenin抗体覆盖细胞,4℃孵育过夜。第二天加入抗兔荧光二抗,避光孵育后DAPl染核,荧光显微镜拍照并计数分析。9.酶联免疫吸附实验(ELISA)小鼠血清DKK3浓度、Ang(1-7)、炎症因子白介素1β(IL-]β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度用ELISA试剂盒检测。操作步骤均按照试剂盒说明书进行,重复三次取平均值。10.小鼠心功能及病理学检测小鼠处死前(第31天)用小动物超声仪进行心功能的检测。在第3天和第31天尾静脉测量小鼠血压。处死前测量小鼠体重和胫骨长度,处死后进行心脏灌洗,然后吸干水分称量心脏重量,计算心重比(HW/BW)及心胫骨比(HW/TL)。取下心脏后进行大体标本拍照比较。11.组织病理学和免疫组织化学小鼠心脏取下后浸泡在4%多聚甲醛中,24小时后流水冲洗过夜,在心尖部中下1/3的位置进行石蜡包埋。然后切片,厚度为5μm。进行H&E、Masson染色。免疫组织化学所用一抗为兔抗ACE2、兔抗胶原Ⅰ、胶原Ⅲ,兔抗CD45、CD68以及兔抗IL-6,二抗为北京中山金桥公司生产试剂盒,按照说明书进行操作,应用Image-Pro Plus 6.0进行数据分析。4.研究结果泵入血管紧张素后,尾静脉注射DKK3过表达病毒的小鼠比仅注射生理盐水的小鼠心脏肥大和间质纤维化水平明显减轻,而且心肌肥大相关指标ANP和β-MHC明显减少;纤维化相关指标胶原Ⅰ和胶原Ⅲ明显减少,心肌炎症反应降低;在体外实验中,DKK3过表达还可以减少心肌成纤维细胞的增殖和炎症反应,抑制磷酸化GSK-3β表达,减少β-catenin核转录;另外DKK3过表达可以降低磷酸化的ADAM]7的表达,进而增加ACE2的表达,促进血管紧张素Ⅱ的降解,增加Ang(1-7)的含量;当敲减DKK3时,磷酸化ADAM17表达增多,导致ACE2表达下降。同时,DKK3过表达还可以抑制AngⅡ诱导的TGF-β1信号通路激活,DKK3敲减可以增强TGF-β1信号通路。5.研究结论DKK3过表达能够抑制血管紧张素Ⅱ引起的心肌肥厚和纤维化,其机制与抑制GSK-3β和β-catenin,并且减少β-catenin核转录有关;另外DKK3过表达可以降低磷酸化的ADAM17的表达,进而增加ACE2的表达,促进AngⅡ的降解,增加Ang(1-7)的含量;同时,DKK3还可以抑制AngⅡ诱导的TGF-β1信号通路激活。