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光合作用是植物生物学产量的源泉,通过基因工程手段人为加强“C4特性”在C3遗传背景下的发挥,实现C3植物光合途径的C4化,对于提高作物光能利用率和产量具有重要意义。本试验从酶活和光合均高的玉米自交系中克隆了玉米C4型丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）和依赖于NADP的苹果酸酶（NADP-ME）基因,并利用PPDK和本实验室先前克隆的PEPC基因（GeneBank:FJ415327）转化拟南芥,研究了这两个基因的单独及协同作用,通过其生理生化方面的变化,为C3作物光合效率的改善提供了候选基因,为C4途径关键酶导入小麦等C3作物提供了依据。主要结论如下：1.利用同源克隆技术,从玉米中克隆了PPDK（GenBank:GU363532）和NADP-ME基因的cDNA,并插入双元表达载体pCAMBIA3301.pCAMBIA1391中,构建了p3301-PPDK、 p3301-ME和p1391-ME融合表达载体。序列测定结果表明,PPDK基因长度为3004Bp,包含一个起始密码子和971个氨基酸的开放阅读框,与己登陆的玉米PPDK基因（GeneBank: BT054438）相比,氨基酸序列同源性可达99.4%；NADP-ME基因长度为2127Bp,包含一个起始密码子和636个氨基酸的开放阅读框,与已登陆的玉米NADP-ME基因（GenBank: NM001111843.1）相比,氨基酸序列同源性可达99.6%。2.Southern blot表明玉米PPDK、PEPC基因已整合到拟南芥基因组中,拟南芥转化率为0.69%,双基因共转化率为0.07%,66.7%的双基因拟南芥符合Mendel单基因的遗传规律。利用农杆菌介导法将p3301-PPDK和本实验室曾构建的p3301-PEPC高效表达载体导入拟南芥中,筛选到327株抗性转基因拟南芥,其中PEPC株系125株,PPDK株系175株,PPDK、 PEPC共表达株系12株,转p3301株系15株,筛选到PPDK、PEPC、PPDK+PEPC、p330.纯系各24、26、8、3个。3.RT-PCR、荧光定量PCR、Western blot分析表明外源基因在拟南芥基因组中得到正确表达,且转PPDK、PEPC基因植株的表达量存在较大差异。荧光定量PCR分析现蕾期PPDK、 PEPC基因的相对表达量分别在1.0-4.2倍和1.0-13.3倍；用Quantity One软件对Western blot进行定量分析表明,PPDK、PEPC基因的蛋白相对表达量分别在1.9-2.5倍和1.6-3.7倍。4.转单、双C4关键酶基因均可以提高拟南芥光合速率,双基因的平均光合速率高于转PEPC基因的平均光合速率,转PEPC基因的平均光合速率高于转PPDK基因的平均光合速率。T3代转基因拟南芥酶活和光合速率测定表明：T3代转基因拟南芥PPDK、PEPC酶活分别比对照增加0.61-3.63倍和0.77-4.81倍,平均增加1.89和1.48倍；转PPDK基因拟南芥光合速率增加3.3-25.3%,平均增加12.2%,转PEPC基因拟南芥光合速率增加6.5-35.1%,平均增加18.9%,双基因（PPDK+PEPC）拟南芥光合速率增加12.6-45.7%,平均增加26.3%。5.转单个C4关键酶基因加速了C4微循环。T4代转基因拟南芥酶活测定表明：PK17-1-2、 PK26-3-2的PEPC酶活分别比对照增加18.65%和46.37%,与对照差异极显显著；PC65-4-6、PC73-1-3的PPDK酶活分别比对照增加12.96%和26.54%,与对照差异极显著,说明转PPDK基因拟南芥可引起PEPC活性增加,反之亦然；T4代转基因拟南芥光合测定表明：PK17-1-2、 PK26-3-2、PC65-4-6、PC73-1-3的光合速率分别比对照增加了13.14%、23.29%、18.14%、36.44%,达极显著水平。6.PPDK、PEPC共表达有协同效应。双基因株系PKC6-5-1的光合速率比PK26-3-2和PC73-1-3的高,但是PKC6-5-1的PEPC酶活比PC73-1-3的低,PKC6-5-1的PPDK酶活比PK26-3-2的低；双基因株系PKC17-1-3的光合速率比PK17-1-2和PC65-4-6的高,但PKC6-5-1的PPDK和PEPC酶活偏低。