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目的：器官移植的理想状态是免疫耐受,即在停用免疫抑制剂后不仅能维持移植物功能,但同时保留受者对外源性抗原的免疫应答。部分器官移植受者在停用免疫抑制剂后并未出现移植物排斥反应,特别是在肝移植受者中较常见。研究表明CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Tregs)介导的免疫调节在诱导移植物免疫耐受中起重要作用。Tregs能下调机体对同种异体抗原的免疫应答。Tregs细胞在维持外周免疫耐受及稳定中起到了关键作用。影响Tregs细胞发育及活性发挥的因素很多,新近发现的叉头/翼状螺旋转录因子(forkhead box P3,小鼠为Foxp3,人类为FOXP3),因其直接主控Tregs细胞表型及活性,在机体自身免疫的稳定中起到了决定性作用,成为研究Tregs细胞调控的焦点。本研究应用流式细胞仪检测了不同免疫抑制方案(雷帕霉素、钙调蛋白抑制剂)肝移植受者外周血Tregs数量及FOXP3 mRNA表达,同时体外分析研究CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的免疫抑制功能,旨在探索不同免疫抑制剂对肝移植受者外周血CD4+CD25highFOXP3+调节性T细胞数量和功能的影响,Tregs细胞角度证实何种免疫抑制剂有利于肝移植受者免疫耐受的建立,从而为临床更为合理选用免疫抑制方案提供理论依据。
方法：
1、选择47例应用不同免疫抑制方案肝移植受者(肝功能稳定大于2年)和38例年龄性别相配的健康人群作为正常对照组,肝移植受者免疫抑制方案分2组[雷帕霉素组15例,钙调蛋白抑制剂组(他克莫司)32例]。流式细胞仪检测外周血单个核细胞CD4、CD25和FOXP3的表达水平。比较各组之间外周血Tregs水平的差异。
2、采用Real time PCR.分析上述肝移植受者和健康人群外周血单个核细胞FOXP3mRNA表达水平。
3、通过对上述肝移植受者外周血中CD4+CD25+调节性T淋巴细胞抑制CD4+CD25.T淋巴细胞功能与健康人群外周血中CD4+CD25+调节性T淋巴细胞抑制CD4+CD25-T淋巴细胞功能对比的分析,探讨CD4+CD25+调节性T淋巴细胞在不同免疫抑制剂的影响下功能有无障碍,同时探讨何种免疫抑制剂有利于免疫耐受的建立。
结果：外周血Tregs占总淋巴细胞的比例,雷帕霉素组显著高于钙调蛋白抑制剂组和正常对照组,钙调蛋白抑制剂组显著低于正常对照组。雷帕霉素组显著高于钙调蛋白抑制剂组和正常对照组[0.50％(0.42 to0.86)vs.0.15％(0.12 to0.22)vs.0.22％(0.12 to0.49),P＜0.01],钙调蛋白抑制剂组显著低于正常对照组(P=0.03)。大于95％CD4+CD25highT细胞、小于20％的CD4+CD25lowT细胞和O％的CD4+CD25-T细胞表达FOXP3。采用Real time PCR研究分析在应用不同免疫抑制方案肝移植受者和正常对照组外周血单个核细胞FOXP3mRNA的表达。雷帕霉素组显著高于钙调蛋白抑制剂组和正常对照组,钙调蛋白抑制剂组FOXP3mRNA表达显著低于健康对照组(P＜0.01),均具有统计学意义。分选的CD4+CD25+及CD4+CD25-T细胞在不同的比例下进行培养,MTT法测定A值并进行抑制率的计算,发现无论是何种免疫抑制方案的肝移植受者还是健康人群,当CD4+CD25+和CD4+CD25-T细胞的比例为1:1时有最大的抑制率。与健康对照者的CD4+CD25+Tregs细胞的增殖能力相比,肝移植受者CD4+CD25+Tregs细胞的增殖能力无明显差异(P＞0.05),从不同免疫抑制方案的肝移植受者分离的Tregs细胞对健康人群分离的效应细胞的增殖抑制力无明显差异。
结论：不同免疫抑制方案对肝移植受者外周血Tregs的数量产生不同的影响。从调节性T细胞的角度雷帕霉素更有助于肝移植受者产生免疫耐受,然而钙调蛋白抑制剂阻碍免疫耐受的建立。本实验研究表明,外周血Tregs的水平与FOXP3mRNA在外周血单个核细胞的表达呈正相关。不同免疫抑制剂的肝移植受者外周血CD4+CD25high FOXP3+Tregs细胞保持正常的免疫抑制功能,表明雷帕霉素在增加Tregs水平的前提下,更有利于免疫耐受的建立。