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研究背景:子宫内膜异位症（EM）发病率逐年增高,复发率较高,对患者的身心健康产生了严重影响。近年来,手术切除治疗和激素类药物治疗仍是EM的主要治疗方式,但存在不良反应较多、复发率较高的问题。EM的发病机制尚不明确,但腹腔巨噬细胞在EM进展中发挥重要作用。EM患者的腹腔环境中巨噬细胞的数量和活力均有所增高,细胞因子的产生量也增加,但这些巨噬细胞的吞噬功能却显著减弱了,而巨噬细胞吞噬能力减弱的原因及其机制尚不明确。免疫检查点在巨噬细胞吞噬作用中发挥重要作用。巨噬细胞相关免疫检查点CD47-SIRPα通路是固有免疫中重要的自我保护机制,目标细胞表面的CD47与巨噬细胞表面的SIRPα相结合,导致巨噬细胞的吞噬功能减弱,从而实现了目标细胞的免疫逃逸。CD47阻断是肿瘤免疫治疗的新方向,并且已在非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、小细胞肺癌及非肿瘤性疾病—动脉粥样硬化等疾病的治疗中取得了实质性进展。PD-1-PD-L1途径通常被认为是癌细胞逃避适应性免疫应答的关键机制,但也有证据表明,PD-1在肿瘤相关的巨噬细胞表面表达,体内阻断PD-1-PD-L1信号通路可增加巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。在许多临床前肿瘤模型中,阻断CD47或PD-L1或两者同时阻断增加了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬清除,表现出显著的抗肿瘤活性。研究目的:探讨基于巨噬细胞相关免疫检查点阻断治疗EM的可能性,阐明CD47-SIRPα及PD-1-PD-L1通路在EM中的表达情况,进而明确CD47及PD-L1在逃避巨噬细胞吞噬中的作用机理,并利用抗体阻断该通路研究其对EM进程的影响。研究方法:1.组织多重免疫荧光法定位CD47及PD-L1在EM患者在位及异位子宫内膜组织中的表达,并使用RT-PCR定量组织中CD47及PD-L1 mRNA水平的表达。进一步,使用流式细胞术定量原代子宫内膜间质细胞（ESCs）和HESCs细胞系中CD47及PD-L1蛋白水平的表达。2.使用小干扰RNA构建CD47低表达的子宫内膜间质细胞（包括HESCs细胞系及原代ESCs）,并将其与人外周血单核细胞诱导来源的巨噬细胞或THP-1细胞系诱导来源的巨噬细胞按1:2的比例直接共培养,共培养24h后利用流式细胞术检测巨噬细胞吞噬ESCs的能力,并分析共培养后ESCs的凋亡改变。3.体外构建子宫内膜间质细胞与巨噬细胞共培养体系,并使用CD47或PD-L1单抗治疗。体外HESCs与巨噬细胞直接共培养时加入CD47中和抗体阻断CD47-SIRPα信号通路或加入PD-L1中和抗体阻断PD-1-PD-L1信号通路,共培养结束后利用流式细胞术检测巨噬细胞吞噬能力的改变。4.体内构建原代ESCs与巨噬细胞共培养体系,并使用CD47单抗治疗。体内共培养即使用CD47中和抗体封闭小鼠原代ESCs表面的CD47抗原,经PKH67染色后将其注射入受体小鼠腹腔形成ESCs异位的状态,12h后获取小鼠腹腔细胞悬液,利用腹腔巨噬细胞常用标记F4/80及CD11b区分大腹腔巨噬细胞（LPMs）及小腹腔巨噬细胞（SPMs）,评估CD47阻断后两者吞噬能力的改变,并对异位ESCs的凋亡率进行评估。研究结果:1.CD47在EM异位病灶中表达上调,而PD-L1的表达并未上调。定位结果显示,异位子宫内膜组织中多个区域可以定位到CD47的表达,但仅有少数区域可观察到PD-L1的表达。RT-PCR结果表明,异位子宫内膜中CD47 mRNA的表达明显高于EM在位内膜及对照组在位内膜,且后两者CD47mRNA表达无统计学差异;PD-L1 mRNA水平在正常对照及EM异位及在位内膜组织中均无统计学差异。流式细胞术的结果表明:CD47在EM在位、异位以及正常对照组在位原代ESCs中均有所表达,但在异位ESCs中的表达明显高于后两者,且后两者中CD47表达无统计学差异;HESCs细胞系存在高水平CD47的表达。PD-L1在三组原代细胞中的表达无统计学差异。因此,通过多种方法、不同层面的分析,我们证实了 CD47在EM异位病灶中表达上调,而PD-L1的表达并未上调。2.CD47高表达使ESCs实现了吞噬逃逸及凋亡逃逸。构建CD47低表达的HESCs,并与巨噬细胞进行共培养,结果表明:巨噬细胞对HESCs的吞噬清除能力增强,且后者凋亡率增加。相较于CD47低表达的在位ESCs,CD47高表达的异位ESCs更容易逃脱巨噬细胞的吞噬清除,从而实现免疫逃逸。下调异位ESCs表面CD47的表达后,巨噬细胞对其吞噬清除增强。以上结果表明了 CD47表达量与吞噬逃逸以及凋亡逃逸之间的关系,即CD47高表达使ESCs实现了吞噬逃逸及凋亡逃逸。3.中和抗体阻断CD47增强了巨噬细胞的吞噬能力。体外共培养体系中,阻断CD47增强了巨噬细胞吞噬清除HESCs的能力;在共培养体系中加入PD-L1中和抗体并不能够改变巨噬细胞对HESCs的清除能力,这与EM异位病灶中PD-L1表达未上调的结果相对应。4.CD47阻断增强体内巨噬细胞的吞噬能力和ESCs的凋亡。体内ESCs与巨噬细胞共培养早期,主要是LPMs负责异位ESCs的清除,这与LPMs更早地募集至炎症发生部位相关。使用CD47单抗治疗能够增强LPMs的吞噬能力,同时增加了异位ESCs的凋亡率,从而延缓了 EM的发生。而SPMs的吞噬能力在共培养早期并不因为CD47抗体的治疗而改变。结论:1.CD47在EM异位病灶中表达上调,而PD-L1表达并未上调。2.异位ESCs表面CD47高表达使其实现了吞噬逃逸及凋亡逃逸。3.靶向CD47,增加了巨噬细胞对异位ESCs的吞噬清除并诱导后者凋亡。