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在全球范围内,宫颈癌是妇女第二位高发的恶性肿瘤。我国是宫颈癌的高发区,在经济落后地区,宫颈癌的危害更为严重。慢性高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)的感染是宫颈癌的主要诱因。此外,低危型HPV中的HPV-6,-11可诱发90%的生殖器疣。在世界范围内,高危型HPV-16、-18是位居前两位的优势流行病毒株,诱发约70%的宫颈癌。在我国,除HPV-16,-18外(检出率分别为58.7%和11%),高危型HPV-58的检出率也很高(7.2%),居于第三位。因此,针对HPV-16,-18,-58疫苗的相关研究值得重视。目前国外已有两种HPV L1病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)疫苗上市,分别是Merck公司利用酵母表达体系生产的含四价疫苗(HPV-16、-18、-6、-11L1VLPs),及GSK公司利用杆状病毒-昆虫细胞表达生产的二价疫苗(HPV-16、-18L1VLPs)。临床实验结果显示,两种疫苗均具有很好的安全性、免疫原性及保护性,而且疫苗的免疫保护活性与疫苗接种血清中和抗体的水平具有很好的相关性。由于HPV感染严格限制在人的上皮组织、生活周期为上皮分化依赖的,体外难以大量培养获得病毒颗粒,缺乏有效的动物模型,因此准确评价疫苗接种人群后诱发的血清中和抗体水平存在很大的困难。另外,和大多数基因工程蛋白不同,HPV L1VLPs属于高度组装的重组蛋白,诱发的保护性抗体识别的表位大多是L1蛋白构象依赖的。变性或错误折叠的L1蛋白不具有保护活性,其越接近天然病毒,保护活性越高,因此在疫苗研制过程中需要对体外表达获得的L1重组蛋白的活性进行检测。HPV中和单抗可用于检测L1重组蛋白中诱发保护性抗体的活性位点。H16.V5和H18.J4分别是国外报道的HPV-16、-18型特异性构象表位依赖中和单抗,均已被应用于ELISA方法对HPV-16、-18L1VLPs疫苗生产过程中的有效成分的质量控制；此外H16.V5和H18.J4还被用于建立竞争性免疫分析方法(Competitive Luminex immunoassay, cLIA),对免疫人群产生的HPV-16,-18型特异性中和抗体进行高通量评价,结果显示基于H16.V5的cLIA方法灵敏,检测结果与中和抗体实际水平一致；但基于H18.J4的cLIA方法的灵敏度较差,某些cLIA阴性血清中仍可检测到HPV-18中和抗体,有待于进一步优化；目前未见有包含HPV-58VLPs的疫苗问世,也未见有HPV-58单抗应用于疫苗研究的报道。对HPV感染机制的初步研究结果表明L1蛋白包含多个涉及病毒感染入胞的关键位点,目前这些位点的序列特征尚不清楚,对其进一步的研究需要多种不同类型单抗的辅助。本实验室正在研发包含HPV-16,-18,-58型多价L1VLPs混合性疫苗,为了配合适合我国国情L1VLPs疫苗的研发,本研究采用杂交瘤技术,制备针对HPV-16,-18,-58的中和单抗,分析了抗体的中和活性即具有50%感染抑制率时的单抗浓度(50%inhibitory concentrations, IC50)、单抗表位特征、单抗间及单抗与H16.V5、H18.J4标准株的识别表位是否一致等。在此基础上建立了基于HPV-16中和单抗的双抗夹心ELISA方法,对L1VLPs进行定量检测。研究结果为HPV-16、-18.-58L4VLPs疫苗的研发及HPV感染入胞机制的深入研究打下了基础。获得了10株HPV-16构象表位依赖中和单抗,IC50范围为0.03-1.72nM。所识别表位的性质与H16.V5一样依赖于病毒子粒；相加实验显示除XM16-1和XM16-5、XM16-3和XM16-6疑似分别识别相同表位外,其它单抗的识别表位均不同,且与H16.V5的表位不同；交叉中和活性分析显示,除XM16-17可交叉中和HPV-18外,其余均为型特异性中和单抗。还获得了10株线性表位依赖中和单抗,IC50范围为1.78-4.17nM,其中有5株可交叉中和HPV-18和/或-58,如XM16-13、XM16-16、XM16-20可交叉中和HPV-18,XM16-15可交叉中和HPV-58,XM16-14可交叉中和HPV-18、-58。以构象表位依赖单抗XM16-6为捕获抗体、HRP标记的线性表位依赖单抗XM16-12为酶标抗体建立了双抗夹心ELISA方法,测定范围为0.05-1.5μg/mL,稳定性好。获得了7株HPV-18型特异性构象表位依赖中和单抗,IC50范围为0.04-0.89nM。所识别表位性质与H18.J4(识别表位依赖于完整VLPs)不同,均为子粒内表位；相加实验结果提示单抗间识别表位均不相同,也不同于H18.J4的识别表位。还获得了6株线性表位依赖中和单抗,IC50范围为0.44-2.34nM,其中3株(XM18-12、XM18-13、XM18-14)可交叉中和HPV-6,其余均为型特异性单抗。获得了7株HPV-58型特异性构象表位依赖中和单抗,IC50范围为0.045-1.0nM；其中3株单抗(XM58-6、XM58-7、XM58-8)识别表位依赖于完整VLPs,其余均识别子粒内表位；相加实验结果提示各单抗间识别表位均不同。还获得了9株线性表位依赖中和单抗,IC50范围为0.44-1.17nM；其中XM-21和XM58-14可交叉中和HPV-18,XM-24可交叉中和HPV-6,而XM58-13可交叉中和HPV-11,其余为型特异性单抗。建立了基于线性表位依赖中和单抗XM-22的间接ELIA方法,但该方法稳定性欠佳。结果表明：HPV-16、-18、-58L1VLPs构象表位依赖的中和单抗多是型特异性单抗,型特异性中和活性强。绝大多数构象表位依赖单抗与H16.V5一样识别表位依赖于子粒,并发现H18.J4识别表位依赖于完整VLPs,提示研发获得的各株子粒依赖单抗在疫苗质控及免疫活性检测中具有潜在的应用价值；首次报道了3株识别表位依赖于完整VLPs的HPV-58型特异性中和单抗。线性表位依赖中和单抗中一半具有交叉中和活性,型特异性中和活性较弱。研究获得的3株可交叉中和HPV-6的HPV-18单抗、4株可交叉中和HPV-18或-6或-11的HPV-58单抗尚未见有文献报道,并获得了5株可交叉中和HPV-18和／或HPV-58的HPV-16单抗。以HPV-16中和单抗为基础建立的双抗夹心ELISA方法在疫苗质控中具有应用价值。研究获得的这些特性各异的单抗可望为病毒感染入胞机制的研究及HPV L1VLPs预防性疫苗的研究提供实验材料。