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研究背景:头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)是全球人类第六高发癌,目前主要治疗手段是手术,结合辅助性放疗和化疗。虽然近三十年来在手术方式及放、化疗技术上取得了进步,但这些治疗手段的进步在提高HNSCC患者的5年生存率方面的作用却非常有限。分子靶向性治疗是目前肿瘤治疗研究的一大热点。鉴于在许多人类恶性肿瘤中,如HNSCC、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌、和胰腺癌等,均有过度表达表皮生长因子受体(Epidermal GrowthFactor Receptor,EGFR)的现象,且其表达水平与患者预后、淋巴结转移情况均有相关性,因此靶向EGFR的治疗被认为是一种很有前景的治疗手段。其中EGFR的单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂是研究最为深入的两种药物,并已先后用于临床。但是,临床试验表明它们的疗效比较有限。利用肿瘤抗原冲击致敏树突状细胞(Dendritic Cell,DC)激发免疫系统针对该抗原的特异性免疫应答是目前肿瘤免疫治疗研究中的一个热点。与EGFR的单克隆抗体及小分子酪氨酸激酶抑制剂通过阻断EGFR的信号传导通路来抑制肿瘤细胞生长不同,由DC疫苗所激活的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T-Lymphocyte,CTL)能直接杀伤肿瘤细胞。因此,这种治疗方法有着更高的治疗效率。将EGFR作为靶点,使用EGFR蛋白冲击致敏DC激活机体的主动免疫来治疗高表达EGFR的HNSCC将可能是一种很有前景的新的治疗手段。目前这方面的研究还未见报道。本研究欲利用谷胱甘肽S转移酶(Glutathione-S-Transferase,GST)与EGFR的融合蛋白来冲击致敏DC,进行治疗HNSCC的实验观察。通过体外测定CTL杀伤靶细胞的能力及对荷瘤小鼠的肿瘤生长情况的观察来探讨该种治疗方法的可行性,以期为头颈部鳞状细胞癌的治疗找到一种新的治疗策略。研究目的:重组GST-EGFR融合蛋白;分离培养并致敏DC;通过体外测定CTL杀伤靶细胞的能力及T细胞分泌γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)的水平,明确GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC是否能诱导出抗肿瘤的细胞免疫;进一步观察用重组GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC对HNSCC荷瘤小鼠的治疗作用。研究方法:1.构建GST-EGFR融合蛋白原核表达载体,并诱导表达及纯化。2.分离培养DC,并用GST-EGFR融合蛋白冲击致敏。3.致敏DC免疫小鼠后,取脾分离T细胞,体外测定CTL活性,及T细胞分泌IFN-γ水平。4.建立小鼠荷瘤模型,观察GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC对HNSCC荷瘤小鼠的治疗作用。研究结果:1.构建GST-EGFR融合蛋白原核表达载体,并诱导表达及纯化用RT-PCR扩增高表达EGFR的小鼠HNSCC细胞株SCCⅦ的EGFR细胞外段编码区cDNA,并测序鉴定,确定为预期片段。用扩增产物成功构建pGEX-4T-2-EGFR原核表达载体,经IPTG诱导表达,并纯化后,获得87kDa大小的GST-EGFR融合蛋白;同时我们对pGEX-4T-2空载体也进行了诱导表达,经纯化后获得26kDa大小的GST蛋白,两种纯化得到的蛋白纯度均＞90%。2.分离培养DC,并用GST-EGFR融合蛋白冲击致敏取C3H小鼠的后肢骨骨髓细胞,分离培养DC。培养第五天时流式细胞仪检测CDllc阳性细胞占59.86%。之后分别用GST-EGFR融合蛋白及GST蛋白冲击,于第七天流式细胞仪检测DC,结果CD40、CD80、CD86和MHCⅡ(I-A~k)阳性细胞比例在GST-EGFR融合蛋白冲击的DC组中分别为58.82%、59.88%、89.42%和90.28%,在GST蛋白冲击的DC组中分别为54.32%、55.02%、88.36%和89.04%,在未用蛋白冲击的DC组中分别为17.87%、42.84%、81.07%和80.36%。该结果显示使用蛋白冲击DC后,CD40、CD80、CD86和MHCⅡ(I-A~k)阳性细胞比例均有提高。3.致敏DC免疫小鼠,体外测定CTL活性,及T细胞分泌IFN-γ情况3.1 CTL活性测定CTL活性检测结果显示,在200:1、150:1、100:1和50:1不同的效靶比时,GST-EGFR/DC组靶细胞杀伤率分别为81.71±7.21%、64.05±5.9%、72.21±5.73%和70.51±15.73%,对照DC组的靶细胞杀伤率分别为7.69±2.32%、10.47±2.75%、8.93±0.67%和9.13±1.09%,两组间差异具有统计学上显著性意义(P＜0.05)。然而,GST/DC组在不同的效靶比时其靶细胞杀伤率分别为9.47±4.42%、10.22±4.28%、6.76±3.53%和13.55±8.54%,对照DC组靶细胞杀伤率分别为8.99±5.07%、10.74±6.19%、8.24±3.55%和9.93±1.4%,两组相比没有统计学意义上的显著差异(P＞0.5)。3.2测定T细胞IFN-γ的分泌IFN-γ的测定结果显示,GST-EGFR/DC组IFN-γ浓度为250.36±4.83pg/ml,对照DC组为66.17±18.49pg/ml,两组间差异具有统计学上显著性意义(P＜0.05)。而GST/DC组IFN-γ浓度为84.47±12.96pg/ml,对照DC组为102.64±20.36pg/ml,两组间没有统计学意义上的显著差异(P＞0.05)。4.GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC抑制SCCⅦ实体瘤生长的作用4.1 GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC对肿瘤的治疗作用各组小鼠均于接受DC免疫之前先接种肿瘤细胞。DC组和GST/DC组小鼠在肿瘤体积上都表现出一种渐进性的快速增长,在肿瘤细胞接种28天后,两组的肿瘤体积分别为6626.59±1497.07mm~3和6126.58±2134.65mm~3,两组间没有统计学意义上的显著差异(P＞0.05);而GST-EGFR/DC组小鼠的瘤体体积增长速度与DC组和GST/DC组相比要缓慢的多,在肿瘤细胞接种后的第28天,该组的肿瘤体积为3655.43±2238.51mm~3,与DC组和GST/DC组的差异均有统计学上显著性意义(P＜0.05)。此外,GST-EGFR/DC组小鼠的平均生存时间为44±6.38天,也显著长于DC组的36.43±4.24天和GST/DC组的37.17±3.13天,这种差异具有统计学上显著性意义(P＜0.05)。4.2 GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC对肿瘤生长的预防作用各组小鼠均在接受DC免疫之后再接种肿瘤细胞。DC组和GST/DC组小鼠的肿瘤体积在肿瘤细胞接种26天后分别为9309.32±3493.99mm~3和8453.35±2049.26mm~3,两组间没有统计学意义上的显著差异(P＞0.05);GST-EGFR/DC组小鼠的肿瘤生长较DC组和GST/DC组明显减缓,在肿瘤细胞接种后的第26天该组的肿瘤体积为3911.5±1656.45mm~3,与DC组和GST/DC组相比均有统计学意义上的显著差异(P＜0.05)。GST-EGFR/DC组小鼠的平均生存时间为52.75±3.3天,也显著长于DC组的43.75±5.74天和GST/DC组的41.6±5.37天,这种差异具有统计学意义上的显著差异(P＜0.05)。讨论:1.CDllc是小鼠DC的特异性表型,其测定结果能反映DC的纯度,我们的结果与文献中采用同样方法分离培养DC所得的DC纯度一致。CD40、CD80和CD86为共刺激分子,DC成熟时它们的表达会增多,同时MHCⅡ的表达也会增多。实验结果显示使用蛋白冲击DC后,这些分子的表达均增加,提示DC成熟度上升。2.CTL和IFN-γ的测定结果提示GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC能有效诱导靶向高表达EGFR的HNSCC的CTL,并使T细胞IFN-γ分泌水平上升,而该作用与GST蛋白无关。3.动物体内实验观察结果提示GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC同时具有治疗性和预防性抗高表达EGFR的HNSCC实体瘤的作用,能显著抑制实体瘤的生长,并延长荷瘤小鼠的生存时间。同样,该作用与GST蛋白无关。结论:1.成功获得高纯度GST-EGFR融合蛋白和GST蛋白。2.分离致敏了DC。3.GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC能有效诱导靶向高表达EGFR的HNSCC的免疫反应。4.GST-EGFR融合蛋白冲击致敏的DC同时具有预防性和治疗性抗高表达EGFR的HNSCC实体瘤作用。