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目的:本课题组最近研究发现apelin-13通过ERK1/2促进肺腺癌A549细胞自噬发生，然而自噬的作用并不明确，本课题组前期研究以及文献报道表明自噬参与细胞迁移调控，因此本研究意在探讨apelin/APJ对肺腺癌细胞迁移的影响以及apelin/APJ诱导的自噬是否参与apelin对细胞迁移调控，阐明apelin/APJ影响肺腺细胞迁移的自噬-PAK1-cofilin的胞内机制，初步评估apelin/APJ系统在肺癌转移中的靶标作用，为肺癌转移治疗提供新的有效靶点。方法:1.细胞迁移检测：Wound healing、Transwell2.ELISA:检测apelin分泌3.Western blotting:检测APJ、p-PAK-1、PAK-1、p-cofilin、 cofilin、LC3等相关蛋白的表达4.基因转染：通过转染，检测相关基因高表达与低表达对细胞功能的影响5.MTT:研究阿霉素和雷佐生对A549细胞活力的影响6.AO/EB染色:荧光染色观测阿霉素、雷佐生对细胞凋亡影响结果:1. Apelin-13诱导肺腺癌细胞迁移Transwell结果显示apelin-13可以剂量依赖的促进肺腺癌A549细胞迁移，其中0.01μM的apelin-13即可明显促进细胞迁移，而0.1μM的apelin-13作用最强。Wound healing证实0.1μM apelin-13时间依赖的促进A549细胞迁移。Transwell和wound healing进一步证实0.1μM apelin-13显著诱导肺腺癌大细胞H460和人高迁移肺腺癌95-D细胞迁移。2. Apelin-13通过APJ诱导肺腺癌细胞迁移构建含APJ的重组质粒载体pcMV-Tag2B-APLNR和APJ的干扰RNAmiR-APLNR-494、miR-APLNR-1712、miR-APLNR-1572序列正确无突变，荧光拍照结果提示重组质粒转染成功且高效，western blotting结果显示转染空载体pcMT-Tag2B对A549细胞APJ表达无影响，而pcMV-Tag2B-APLNR转染明显增加APJ表达， miR-APLNR-494显著抑制APJ的表达，miR-APLNR-1712、miR-APLNR-1572对APJ表达无明显降低作用。Wound healing显示，用或者不用apelin-13处理，与空载体转染组相比，转染pcMV-Tag2B-APLNR促进A549细胞迁移而转染miR-APLNR-494抑制A549细胞迁移，transwell结果证实通过miR-APNLR-494抑制A549细胞APJ表达可以显著降低apelin-13引起的细胞迁移。3. Apelin-13诱导PAK1-Cofilin磷酸化促进肺腺癌A549细胞迁移应用String服务器对apelin与PAK1进行蛋白蛋白相互作用预测，发现apelin与PAK1可能存在相互作用。PAK1抑制剂IPA-3处理能够显著抑制apelin-13诱导的A549细胞迁移。而免疫印迹表明apelin-13处理A549细胞，可时间依赖的诱导PAK1和cofilin磷酸化，IPA-3显著抑制apelin-13诱导的PAK1和cofilin磷酸化，western blot还证实，apelin-13可以显著诱导PAK1蛋白表达，但是对cofilin表达无影响。4.自噬介导apelin-13促肺腺癌A549细胞迁移Apelin-13诱导A549细胞LC3总蛋白和LC3Ⅱ表达。自噬抑制剂3-MA能够抑制apelin-13诱导的LC3Ⅱ生成。A549细胞转染LC3重组质粒后apelin-13孵育，荧光显微镜拍照结果表明apelin-13诱导LC3细胞膜定位。Transwell结果证实自噬抑制剂3-MA可以明显抑制A549细胞迁移，并且抑制apelin-13诱导的迁移，自噬诱导剂雷帕霉素显著促进A549细胞迁移，雷帕霉素与apelin合用对细胞迁移促进作用最强。5.自噬诱导PAK1-cofilin磷酸化介导apelin-13促肺腺癌A549细胞迁移自噬抑制剂3-MA时间依赖的抑制A549细胞中PAK1磷酸化，并且3-MA抑制apelin诱导的PAK1磷酸化，而自噬抑制剂3-MA同样时间依赖的抑制A549细胞中cofilin磷酸化，并且抑制apelin-13诱导的磷酸化。6. Apelin-APJ为肺腺癌迁移治疗的潜在有效靶标MTT分析计算阿霉素对A549细胞的IC50为1.332μM。不同浓度（0.2μM,0.4μM,0.6μM,0.8μM,1μM）的阿霉素处理A549细胞，AO/EB荧光染色结果提示低浓度阿霉素并不显著诱导细胞凋亡。而wound healing结果提示1μM阿霉素可以明显抑制A549细胞迁移，选用1μM阿霉素为实验浓度。Transwell结果证明:阿霉素可以显著抑制A549细胞迁移，而apelin-13能够抵消阿霉素的抑制作用，转染pcMV-Tag2B-APLNR的细胞，阿霉素的作用被逆转，而在转染miR-APLNR-494的细胞，即使用apelin-13处理，阿霉素也显著抑制A549细胞迁移。MTT计算得出雷佐生的IC50为892.164μM，wound healing显示10μM的雷佐生即抑制A549细胞迁移，而AO/EB染色结果显示50μM的雷佐生也不引起细胞凋亡。Transwell结果证明:10μM雷佐生显著抑制A549细胞迁移，而apelin-13能够废除阿霉素的抑制迁移作用，转染pcMV-Tag2B-APLNR后A549细胞迁移明显增加，与未转染组细胞有明显统计学差异，而转染miR-APLNR-494的A549细胞，即使用apelin-13处理，雷佐生也显著抑制A549细胞迁移。7.缺氧诱导肺腺癌A549细胞APJ表达和apelin分泌Western blot结果证实CoCl2处理A549细胞制造缺氧模型，可以时间和剂量依赖的促进A549细胞APJ表达，而ELISA结果证实CoCl2处理A549细胞制造缺氧模型以后，可以时间和剂量依赖的增加A549细胞apelin释放。结论:自噬性磷酸化修饰PAK1-cofilin途径介导apelin-13促肺腺癌细胞迁移