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【研究背景】卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的恶性肿瘤,因为在其诊断时多数已为晚期病例,虽然经过系统的手术、化学治疗,5年生存率仍不超过45%,一直被认为是一个“沉默杀手”。越来越多的学者认识到,肿瘤的生物学行为不仅取决于肿瘤细胞本身的特征,而且与肿瘤间质之间的相互作用密切相关。不同的实体肿瘤虽然实质和间质的比例不尽相同,但是一般肿瘤的间质成分占整个实体肿瘤的50-90%。间质成分毗邻于肿瘤细胞,受到肿瘤细胞旁分泌信号的调节,可以转化为肿瘤相关的间质细胞,因为其改变了细胞的表型、功能和肿瘤局部的微环境,可以促进肿瘤的增殖、浸润、转移和血管形成。肿瘤间质的肿瘤相关纤维母细胞是间质细胞中最主要的细胞成分,其主要来源包括:肿瘤局部的纤维母细胞、上皮间质转化、远处部位的纤维母细胞、骨髓祖细胞、干细胞等。其中,间质纤维母细胞是最主要的细胞成分,其不同于正常的纤维母细胞,因为表达已分化肌纤维母细胞表型标志α-SMA(α-smooth muscle actin),被称为肿瘤相关成纤维细胞或肌纤维母细胞(tumour-associated fibroblasts,myofibroblasts),但其分子转化机制尚不完全清楚。对肿瘤相关成纤维细胞转化激活机制的深入研究,将有助于靶向肿瘤间质治疗新策略的提出。细胞内氯通道蛋白4(Chloride intracellular channel 4,CLIC4),是细胞内的一种氯通道,调节细胞内pH值和细胞体积。它不仅存在于细胞器膜上,而且可以以可溶性成分存在于细胞浆和细胞核内,作为一种通道调节剂或信号蛋白。有研究显示,TGF-β1可以刺激乳腺组织原位的纤维母细胞的CLIC4转录水平升高,更重要的是,CLIC4高表达于乳腺癌组织的间质肿瘤相关成纤维细胞,而正常组织间质中几乎无CLIC4表达。故我们推测CLIC4可能参与上皮性卵巢癌的间质肌纤维母细胞的转化。MicroRNAs(miRNAs)是一类分布广泛的小的非编码蛋白质的RNAs,其功能是负性调控基因表达。在人类基因组中至少存在700个miRNAs(也有可能为1000个),约占人类基因的1-4%,预测他们能够调节至少三分之一的人类基因,这使得其成为最大的一类基因表达调控因子。miRNAs参与生命过程中几乎所有的重要过程,包括早期发育,细胞增殖,细胞凋亡和细胞分化等。肿瘤间质肌纤维母细胞转化过程中存在一系列表型和功能基因的表达改变,但参与此过程调控基因表达的miRNAs尚未见报道。本研究中,我们首先检测上皮性卵巢癌患者组织中CLIC4的表达,并构建间质肌纤维母细胞转化的细胞模型,探讨是否CLIC4参与此转化过程及其在此过程中的作用,进一步探讨调控肿瘤间质肌纤维母细胞转化的miRNAs。第一部分CLIC4介导卵巢癌肿瘤相关成纤维细胞转化【目的】来自肿瘤与间质相互作用的信号分子激活肿瘤间质肌纤维母细胞,其对肿瘤的进展起重要的作用。CLIC4可能参与间质纤维母细胞的激活,但其分子机制尚不清楚。本研究拟探讨CLIC4是否参与上皮性卵巢癌间质纤维母细胞向肌纤维母细胞的转化及其在此过程中的作用。【方法】1.应用免疫组织化学方法检测上皮性卵巢癌组织间质中CLIC4的表达。2.卵巢癌细胞条件培养基(Conditioned medium,CM)或转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)培养原代卵巢正常纤维母细胞或人纤维母细胞系构建卵巢癌肿瘤间质纤维母细胞向肌纤维母细胞转化的细胞模型,应用倒置显微镜观察细胞形态学改变和肌纤维母细胞转化细胞表型标志α-SMA表达上调,评价转化细胞模型成功构建。3.应用肌纤维母细胞转化的细胞模型,证实CLIC4和活性氧产物(reactive oxygen species,ROS)参与此转化过程。4.应用CLIC4特异性siRNA阻断CLIC4的表达,探讨其在肿瘤间质肌纤维母细胞转化中的作用。5.应用CLIC4特异性siRNA阻断CLIC4的表达或氯离子通道抑制剂抑制CLIC4的功能、抗氧化剂阻断ROS水平上调,探讨它们对肿瘤间质肌纤维母细胞转化相关功能蛋白表达的抑制作用。【结果】1.上皮性卵巢癌组织中间质CLIC4的阳性表达率为97.22%,肌纤维母细胞表型标志物α-SMA的阳性表达率为94.44%,两者密切相关性(P＜0.05)。肿瘤间质CLIC4表达强度与患者的肿瘤分化程度和淋巴结转移密切相关,中、低分化者,有淋巴结转移者肿瘤组织间质CLIC4的表达明显高于高分化,无淋巴结转移者(P＜0.05)。2.应用卵巢癌细胞CM或TGF-β1培养卵巢组织原代正常纤维母细胞或人纤维母细胞系MRC-5 48小时,细胞增大呈多角形,而无血清培养的纤维母细胞呈细长纺锤状,同时α-SMA的转录(P＜0.05)和蛋白表达水平显著增加,表明正常纤维母细胞向肌纤维母细胞转化。3.应用卵巢癌细胞CM或TGF-β1培养卵巢组织原代正常纤维母细胞或人纤维母细胞系MRC-5 48小时,纤维母细胞CLIC4表达在转录(P＜0.05)和蛋白水平明显上调。4.应用卵巢癌细胞CM或TGF-β1培养卵巢组织原代正常纤维母细胞或人纤维母细胞系MRC-5促进细胞内ROS的产生,应用抗氧化剂抑制ROS产生可以抑制CM或TGF-β1诱导的CLIC4和α-SMA上调(P＜0.05)。5.应用CLIC4特异性siRNA能够有效阻断CLIC4的表达,抑制CM或TGF-β1诱导的α-SMA表达水平上调(P＜0.05)。6.应用CLIC4特异性siRNA阻断CLIC4的表达或氯离子通道抑制剂抑制CLIC4的功能、抗氧化剂阻断ROS水平上调,可以抑制与肌纤维母转化相关促血管因子VEGFA和HGF mRNA水平表达29-80%(P＜0.05)。【结论】CLIC4参与卵巢癌肿瘤间质纤维母细胞向肌纤维母细胞转化。来自肿瘤的旁分泌信号TGF-β1刺激使纤维母细胞内ROS产生增加,进而促进CLIC4的表达上调,最终导致纤维母细胞向肌纤维母细胞转化,即肿瘤相关成纤维细胞的活化。阻断CLIC4和ROS具有靶向肿瘤间质的治疗前景。第二部分microRNA-21参与肿瘤相关成纤维细胞转化【目的】肿瘤细胞分泌的TGF-β1诱导肿瘤间质肌纤维母细胞的转化表现为一系列表型和功能基因的表达改变。miRNAs作为重要的基因负性调节因子,目前参与肿瘤间质肌纤维母细胞转化的miRNAs尚未见报道。【方法】1.应用real time RT-PCR方法检测一系列候选参与肿瘤间质肌纤维母细胞转化过程相关的miRNAs的表达水平。2.应用microRNA-21(miR-21)抑制物和类似物转染人纤维母细胞,探讨miRNA-21在肿瘤间质肌纤维母细胞的转化过程中的作用。3.应用计算机软件预测肿瘤间质成纤维细胞转化过程中miR-21的靶向调控基因,应用构建包含miR-21靶基因调控程序性细胞死亡4基因(programmed cell death 4,PDCD4)3’-UTR的荧光素酶报告载体方法和应用转染或敲除miR-21后检测纤维母细胞中PDCD4表达水平的变化,确定PDCD4是否是miR-21在肌纤维母细胞转化过程中的靶向调节基因。【结果】1.应用卵巢癌细胞CM或TGF-β1培养人纤维母细胞系MRC-5,细胞内miR-21表达水平上调(P＜0.05),并且具有时间和剂量依赖性效应。2.应用miR-21抑制物和类似物转染纤维母细胞MRC-5,miR-21抑制物特异性降调而其类似物特异性上调miR-21的水平(P＜0.05)。miR-21抑制物可以抑制CM或TGF-β1诱导的肿瘤间质肌纤维母细胞的转化过程中α-SMA等转化标志基因和功能基因的表达(P＜0.05)。3.生物信息软件预测调控PDCD4的3’UTR与miR-21具有明显的相互作用“种子序列”。4.构建含有miR-21潜在结合位点的PDCD4基因3’UTR荧光素酶报告载体,其与miR-21抑制剂或模仿剂共转染入纤维母细胞MRC-5,miR-21模仿剂增加miR-21的表达而抑制荧光素酶活性,而miR-21抑制剂显著增加荧光素酶活性(P＜0.05)。提示,在纤维细胞中miR-21能够结合到PDCD4基因的3’UTR。5.应用特异性转染或沉默方法,miR-21模仿剂和miR-21抑制剂分别降低和升高纤维母细胞中PDCD4的蛋白表达,并且转染miR-21抑制剂可以拮抗TGF-β1诱导的miR-21内源性负性调节PDCD4表达的作用。【结论】miR-21参与卵巢癌细胞CM或TGF-β1诱导的肿瘤间质肌纤维母细胞转化是通过靶向调节PDCD4。