反柄灵芝子实体的化学成分及生物活性研究

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反柄灵芝(Ganoderma cochlear)是一种药食同源的高等真菌,子实体具有抗衰老、改善记忆、抗神经衰弱、抗癌、护肝、降血脂、抗炎等多重生物活性。本文对野生反柄灵芝子实体脂溶性成分进行了系统研究。综合运用正相柱层析、RP-18柱层析、Sephadex LH-20等柱层析手段,结合高效液相色谱法进行化合物分离纯化。通过核磁共振谱(NMR)、紫外光谱(UV)、质谱(MS)、单晶X-衍射等综合波谱学手段和解析技术对单体化合物进行结构鉴定。最终,鉴定了29个化合物(14个新化合物),包括18个羊毛甾烷型三萜化合物,其中13个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17、18)为3,4-裂环-25,26,27三降羊毛甾烷型三萜,化合物4-6为结构新颖的3、4-裂环-25、26、27、28-四降羊毛甾烷型三萜,且4进一步发生了重排,形成新的碳骨架;11个杂萜,包括苯杂单萜单链型,苯杂倍半萜单链型和多环型,以及一个新的苯杂单萜二聚体(20)。根据文献调研及课题组前期研究经验,我们对得率5 mg以上的八种三萜进行了神经营养活性测试,结果表明这些化合物都具有不同程度的依赖神经生长因子NGF(Nerve growth factor)促进PC12细胞突起生长的活性,其中3、11、13和15活性最佳。选取11和15(3μM、10μM、30μM)作进一步浓度梯度试验。结果表明,化合物15促进PC12细胞突起生长呈现剂量依赖性增强,而11在低浓度下有浓度依赖性增强PC12细胞突起生长的活性,但在高浓度下(30μM)则表现为抑制突起生长的作用。用western blot测定生长相关蛋白(GAP43)表达的变化,结果表明,15上调GAP43的表达,并表现出明显的剂量依赖性,与突起生长规律吻合。11在低浓度下确实上调GAP43的表达,但高浓度下对GAP43表达呈现抑制作用,与细胞水平实验吻合。此外,杂萜二聚体20可以有效抑制缺氧复氧诱导的心肌细胞中Fe2+升高,逆转缺氧复氧导致的GPX4和FTH1降低,表现出一定的心脏保护活性。综上,本研究丰富了反柄灵芝子实体中的化合物多样性,发现了三个降碳及降碳后进一步重排的羊毛甾烷型三萜,揭示了特殊生物合成途径的存在;经过细胞水平和蛋白水平的研究,探讨了相关化合物神经营养活性的量效关系、时效关系;和杂萜二聚体的心脏保护活性。本研究揭示了反柄灵芝神经营养和心脏保护作用的物质基础,同时为这种特殊的药食同源高等真菌在神经退行性疾病和心脏相关疾病中的应用和进一步开发指明了方向。
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