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背景:随着免疫抑制剂的广泛使用,皮肤真菌感染的发病率也逐渐增高,但是其具体机制是什么呢?我们推测与机体的天然免疫功能受到抑制有关,天然免疫作为机体抵御外界病原体的第一道防线,在抗真菌感染方面发挥着重要的作用,但是相关研究目前较罕见。所以本实验通过构建体外真菌感染的模型,从天然免疫方面研究长期使用免疫抑制剂易导致真菌感染发病率增高的原因及其具体机制。目的:本实验用酵母多糖诱导Ha Ca T细胞,构建体外真菌感染的细胞模型;检测3种常见的免疫抑制剂环孢素A、环磷酰胺、麦考酚酸酯对正常的和酵母多糖诱导的Ha Ca T细胞Dectin-1、TLR2以及炎症因子TNF-α、IL-6的表达变化,从细胞水平来探讨不同免疫抑制剂、皮肤真菌感染与模式识别受体之间的关联。方法:第一部分:体外培养HaCaT细胞,用不同浓度(0、10、100μg/ml)酵母多糖作用于Ha Ca T细胞24 h,采用荧光定量聚合酶链反应、流式细胞术的方法,检测Ha Ca T细胞中Dectin-1、TLR2m RNA以及蛋白水平的变化,用酶联免疫吸附试验,检测细胞上清液中的TNF-α、IL-6浓度变化,以及细胞爬片免疫荧光染色的方法观察Dectin-1、TLR2蛋白在Ha Ca T细胞中的表达部位。第二部分:体外培养HaCaT细胞,用CCK-8的方法检测不同浓度(100 nM、1μM、10μM、100μM、500μM)的环磷酰胺、环孢素A和不同浓度(10 n M、100n M、1μM、10μM、50μM)的麦考酚酸酯作用Ha Ca T细胞24 h后的生长抑制率,选取最适浓度进行后续实验,用相应浓度的药物刺激Ha Ca T细胞24 h,采用荧光定量聚合酶链反应、流式细胞术的方法检测细胞中Dectin-1、TLR2的m RNA以及蛋白水平的变化,酶联免疫吸附试验的方法验检测上清液中TNF-α、IL-6的浓度变化。第三部分:选取100μg/ml浓度的酵母多糖和相应浓度的免疫抑制剂与Ha Ca T细胞共同培养24h,采用荧光定量聚合酶链反应、流式细胞术的方法检测细胞中Dectin-1、TLR2 m RNA以及蛋白水平的变化,酶联免疫吸附试验的方法验检测细胞上清液中TNF-α、IL-6浓度的变化。结果:第一部分:酵母多糖作用于HaCaT细胞后Dectin-1、TLR2 m RNA和蛋白表达水平均增高(P<0.05),TNF-α、IL-6水平也增高(P<0.05),且呈浓度依赖性,在酵母多糖的刺激下Dectin-1、TLR2蛋白的表达向胞核内转移。第二部分:不同浓度的环磷酰胺、环孢素A、麦考酚酸酯作用Ha Ca T细胞24h后,均对Ha Ca T细胞表现出一定的抑制作用(P<0.05),且随着药物浓度增加其抑制作用越大。因为生长抑制率过高和过低的意义不大,所以环孢素A和环磷酰胺最终选取的相浓度为1μM,麦考酚酸酯的最终浓度为100 n M,进行后续的实验。与对照组相比,环磷酰胺作用于Ha Ca T细胞后TLR2、Dectin-1m RNA和蛋白的表达水平增高,TNF-α、IL-6的水平也升高,但差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,环孢素A和麦考酚酸酯作用于Ha Ca T细胞后,TLR2、Dectin-1m RNA及蛋白水平均降低(P<0.05),TNF-α、IL-6的浓度也降低(P<0.05),差异有统计学意义。第三部分:与对照组比较,环磷酰胺作用于酵母多糖诱导的HaCaT细胞后,TLR2、Dectin-1m RNA和炎症因子表达水平降低,但差异无统计学意义(P>0.05),而环孢素、麦考酚酸酯有统计学意义;与对照组相比,麦考酚酸酯和环孢素A、环磷酰胺作用于酵母多糖诱导的Ha Ca T细胞后,TLR2、Dectin-1蛋白表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05);结论:1.酵母多糖能够激活Ha Ca T细胞中TLR2、Dectin-1的表达,诱导细胞天然免疫的发生;2.环磷酰胺、环孢素A以及麦考酚酸酯对HaCaT细胞的生长具有抑制作用和毒性作用,且与浓度呈正相关;3.麦考酚酸酯、环孢素A对正常的和酵母多糖诱导的Ha Ca T细胞TLR2、Dectin-1及TNF-α、IL-6的表达具有抑制作用,我们推测麦考酚酸酯、环孢素A可能通过TLR2/Dectin-1的信号通路来抑制机体的天然免疫;4.环磷酰胺对正常的和酵母多糖诱导的Ha Ca T细胞TLR2、Dectin-1及TNF-α、IL-6的表达无明显作用,我们推测环磷酰胺可能通过其他的信号通路来抑制机体的天然免疫功能;