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茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]是一种重要的经济作物,茶叶中含有茶多酚、氨基酸、维生素、生物碱等多种活性成分,可以预防癌症、心脑血管等疾病。研究认为,茶的有益活性成分主要是儿茶素。随着研究的不断深入,甲基化儿茶素相继被发现,这种儿茶素被认为比EGCG具有更强的抗过敏和抗高血压功效,且比EGCG更容易被吸收,目前研究较多的主要是Epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)gallate(EGCG3"Me)。之前,本课题组已从多种茶树资源中鉴定出高EGCG3"Me含量的金牡丹和金观音等茶树品种,但关于这些品种高EGCG3"Me的分子调控机制尚不清楚,制约了对这些特异性种质资源的认识。因此,本文在前人已有的研究基础上,探讨EGCG3"Me生物合成的转录调控机制,以期为高EGCG3"Me茶树品种选育提供理论依据,进一步推动特异性茶树种质资源的开发和利用。儿茶素和EGCG3"Me被认为是通过类黄酮生物合成途径合成的,是一个复杂而高度有序的生物学过程。其合成通路上相关基因的表达,如CsLAR、CsDFR、CsANS、CsANR和CCoAOMT等,对茶树儿茶素和EGCG3"Me的积累有着重要的影响。茶树次生代谢的转录调控研究相对滞后,关于转录因子与茶树黄酮类物质的关系虽见报道,比如:MYB、b HLH、WRKY、MADS和WD40等转录因子均被认为与黄酮类物质的代谢有关,但关于这些转录因子所行使的调控功能及其作用机制还研究较少。WRKY是一类植物所特有的转录因子,参与众多生理进程,在植物的生长发育、生物与非生物胁迫和新陈代谢等过程中发挥着重要的调控作用。有研究表明,WRKY类转录因子参与调控拟南芥和水稻等黄酮类物质的积累。但是,WRKY转录因子是否参与及如何调控茶树儿茶素和EGCG3"Me的代谢尚不清楚。为此,本研究以两个高EGCG3"Me含量的茶树品种金观音(JGY)和金牡丹(JMD)及一个不含EGCG3"Me的茶树品种福鼎大白(FD)为研究对象,深入研究了WRKY转录因子调控儿茶素和EGCG3"Me代谢的可能分子机制。主要研究结果如下:1.以不同EGCG3"Me含量的茶树品种(金观音、金牡丹和福鼎大白)为试验材料,分析比较了三个品种间的有参转录组数据文库,从表达谱上共鉴定到“JMD vs FD”差异表达基因12457个;“JGY vs FD”差异表达基因9908个。采用实时荧光定量PCR(RTq PCR)分析了WRKY基因及EGCG3"Me生物合成相关基因CsLAR、CsDFR、CsANS、CsANR和CCoAOMT的表达情况,结果显示CsLAR、CsDFR和CCoAOMT的表达与EGCG3"Me含量的积累模式高度一致,且与表达谱数据相一致。2.克隆并获得了EGCG3"Me生物合成相关基因CsLAR、CsDFR和CCoAOMT的启动子序列。通过启动子在线分析软件plant CARE预测了CsLAR、CsDFR和CCoAOMT启动子区域潜在的顺式作用元件。结果表明:CsLAR、CsDFR和CCoAOMT的启动子包含了TATA框、CAAT等启动子最基本的作用元件,还包含其他许多重要的顺式作用元件如光反应元件、逆境反应元件及MYB、MYC和WRKY等转录因子的结合元件。3.克隆了2个在金牡丹和金观音中下调的WRKY基因CsWRKY31和CsWRKY48,分析了它们参与茶树叶片EGCG3"Me代谢的可能分子机制。RT-q PCR分析发现,CsWRKY31和CsWRKY48在金牡丹和金观音中显著下调表达,与CsLAR、CsDFR和CCoAOMT的表达趋势及EGCG3"Me含量的积累模式相反。进一步特性分析表明CsWRKY31和CsWRKY48为核蛋白且均无转录激活活性,是转录抑制子。更为重要的是,通过凝胶阻滞迁移实验(EMSA)发现CsWRKY31和CsWRKY48的重组蛋白可以直接结合CsLAR、CsDFR和CCoAOMT启动子区域的W-box(C/T)TGAC(T/C)元件;且双荧光素酶报告系统实验(DLR)显示,CsWRKY31和CsWRKY48可以抑制CsLAR、CsDFR和CCoAOMT启动子的活性。这些结果说明CsWRKY31和CsWRKY48作为转录抑制子,可以通过抑制CsLAR、CsDFR和CCoAOMT的表达参与茶树叶片EGCG3"Me的代谢调控。4.克隆了1个在金牡丹和金观音中上调的WRKY基因CsWRKY57like,分析了其参与茶树叶片EGCG3"Me生物合成的作用机制。RT-q PCR分析发现CsWRKY57like的表达与EGCG3"Me含量的积累模式高度一致。亚细胞定位及转录活性分析表明CsWRKY57like定位于细胞核且具有转录激活活性。EMSA和Ch IP-q PCR结果显示,CsWRKY57like可以结合含有W-box(C/T)TGAC(T/C)元件的CsLAR、CsDFR和CCoAOMT启动子。双荧光素酶瞬时表达分析表明CsWRKY57like可以激活CsLAR、CsDFR和CCoAOMT的启动子活性。说明CsWRKY57like可以通过直接激活CsLAR、CsDFR和CCoAOMT的表达正调控EGCG3"Me的生物合成。5.克隆了茶树基因组VQ家族7个基因,采用酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补实验(Bi FC)研究了CsWRKY31、CsWRKY48和CsWRKY57like与茶树VQ家族蛋白的互作情况。结果表明CsWRKY48可分别与CsVQ10、CsVQlike2互作,CsWRKY57like能与CsVQ4互作。酵母自激活分析表明CsVQlike2具有转录激活活性,CsVQ4和CsVQ10没有激活活性,说明它们可能通过激活或者抑制互作蛋白的活性来参与下游基因的调控。这些结果说明CsWRKY48和CsWRKY57like可能通过单独或者以VQ蛋白互作的形式协同调控EGCG3"Me合成相关基因CsLAR、CsDFR和CCoAOMT的表达,共同参与茶树儿茶素和EGCG3"Me的代谢调控。