自1985年发现第一例HIV-1感染者以来,至今大约有HIV-1的感染者和AIDS病人65万。HIV-1毒株在与宿主相互作用的过程中为了逃逸免疫系统的监控不断进行自身的调节以及环境因素的影响和病毒独特的逆转录复制方式导致了病毒在HIV-1流行的过程中形成了不同的亚型及亚型的重组形式。目前发现我国存在A、B、B’、C、D、G、F共7种亚型HIV-1毒株,另外还有不同亚型毒株的重组形式。2000年流行病调查结果显示我国主要HIV-l的流行毒株以CRF-B’C、B’和CRFO1-AE为主,与1998年全国HIV-1分子流调相比,B’亚型已由原来的第一位降至第二位,而CRF-B’C重组模式则上升为第一位。2003年我国的分子流行病学调查结果显示B’C亚型毒株比率在不同亚型中已达到50.20%。流行病调查结果提示B’C重组毒株可能具有传播优势。不同亚型的HIV-1病毒在疾病的传播和致病能力方面具有很大的差异,即有在急性感染阶段就快速发展为AIDS,甚至在几个月内就死亡的病人;也有在感染15年以后仍然没有任何临床表现和实验室改变,保持相对健康的病人。HIV-1病毒的致病性是HIV-1病毒和宿主相互作用的结果。在选择性的压力下HIV-1病毒的高度变异性导致病毒在传播和感染进程中,病毒的生物学特性不断发生变化。从感染早期使用CCR5辅助受体利于病毒的传播到疾病的晚期阶段转化为利用CXCR4辅助受体,导致疾病的迅速进展。由此可见病毒受体利用的变化又可导致病毒感染和复制能力的改变.病毒的这种生物学特性的变化是病毒不断适应宿主环境变化进行自身调整,从而保持病毒的复制和致病能力的结果。病毒生物学特性的改变与基因的变异是紧密相关的。但决定和影响HIV-1毒力的因素非常复杂。HIV-1 env糖蛋白是病毒侵入和黏附于靶细胞的部位,与病毒的体液和细胞免疫逃逸、细胞嗜性和辅助受体利用的转变以及致病性有密切关系。HIV-1 env基因中V1、V2和V3环不仅决定了病毒与CCR5还是与CXCR4结合还与病毒毒力的变化密切相关。大量的国外文献报道病毒V3环的电荷数、11,25位点氨基酸的改变及糖基化位点糖蛋白的丢失等都可导致HIV-1病毒辅助受体利用的改变,但辅助受体使用的转变常常伴随着env基因致死性突变和复制适应性的下降,病毒需要及时进行氨基酸的替换以挽救和弥补病毒致病性的改变。而V1/V2区的突变能够补偿V3区的有害和致死性突变,并发生于V3区的突变之前,从而使病毒存活并保持复制和致病能力,表现出HIV-1的精细的自我调节机制。GP120表面的糖蛋白有识别和黏附功能。V1、V2、V3及其V3环的邻近区域的N-糖基化位点的改变导致病毒利用辅助受体和病毒感染性的改变,对病毒的传播能力具有潜在影响。通过使用病毒胞膜糖蛋白抑制剂,结果发现糖蛋白的封闭影响了病毒与CD4+T淋巴细胞的结合和病毒在细胞间的传播。因此认为GP120表面糖蛋白的位置,数量对病毒利用辅助受体及病毒的感染性有决定作用。HIV-1病毒复制水平可决定疾病的进程,快速进展期患者体内的HIV-1病毒的复制水平很高,致使CD4细胞水平迅速下降进入AIDS期。病毒的复制能力与病毒疾病的严重程度相关,而调节病毒复制的因素是错综复杂的。目前研究比较多的是HIV-1病毒的调节基因tat对病毒复制的调节作用。文献报道体外表达纯化的Tat蛋白具有生物学活性,可以反式激活LTR引导的报告基因的表达。Tat蛋白特定位置的氨基酸变异可以引起病毒生物学活性的改变,进而影响病毒的复制和传播。因此研究GP120,tat对病毒生物学特性改变的影响和揭示病毒复制能力的差异有重要的意义。B’和B’C亚型是我国的主要的流行株,尤其是B’C亚型的传播效率成为了我国HIV-1预防和控制所关注的焦点之一。病毒表型的改变是由于基因变异所致。了解病毒生物学特性和导致病毒特性改变的分子基础是为预防和控制HIV-1的蔓延提供理论依据。为了阐明我国主要HIV-1流行株B’C重组毒株和B’亚型毒株的生物学特性,我们从病毒利用辅助受体,融合进入细胞到病毒复制产生致病性三个层面阐述不同亚型病毒株的生物学特性。通过相关区域的基因序列的变化阐述导致病毒表型改变的相关的分子基础。目的1探讨B’亚型和B’C重组亚型分离毒株在疾病进展过程中辅助受体利用与CD4细胞计数和病毒载量的关系.2研究我国主要流行毒株B’亚型和B’C亚型毒株感染性和复制动力学的生物学特性的差异。3通过扩增GP120基因片段和序列,探讨B’亚型和B’C亚型辅助受体利用和病毒感染性的差异与GP120基因序列的相关性。4通过扩增tat基因和序列的测定分析影响病毒复制能力的关键位点。方法1研究对象2004年至2005年底静脉采集71份HIV-1血样,其中山西8份,河南14份,安徽30份,新疆25份。男40名,女31名,平均年龄37岁(27-50岁)。所有个体均签署了知情同意书并且均未接受过抗病毒治疗。收集的病例全部确诊为HIV-1的患者。血液样本离心分离血浆和外周血单个核细胞(PBMCs),用于病毒分离。2病毒分离通过传统的共培养方法。患者的PBMCs与至少两个正常人的经PHA刺激培养2-3天的PBMCs共同培养。用HIV-1 p24抗原检测试剂盒监测培养上清HIV-1病毒颗粒释放,共培养4周3病毒辅助受体的检测利用相同剂量的病毒分别感染稳定表达不同辅助受体CCR5和CXCR4的GHOST细胞,感染48-72小时,通过流式细胞仪分析GFP表达。4病毒感染性的检测使用2ng的p24病毒量感染表达不同辅助受体CCR5和CXCR4的GHOST细胞,感染后24小时收获细胞,流式细胞仪分析GFP表达。5病毒复制动力学的检测使用2ng的P24抗原的HIV-1病毒量感染经PHA刺激48-72小时的从不同的HIV阴性的人体内分离外周血单核细胞(PBMC)细胞,在感染后的第1、3、5、7、10、15天取上清使用酶联免疫法(ELISA)检测HIV-1病毒P24抗原的滴度。6 HIV-1 GP120和tat基因序列分析从复制病毒PBMCs细胞中提取DNA,运用巢式-聚合酶链反应(nest-polymerase chain reaction,nest-PCR)扩增GP120和Tat基因片段,PCR扩增产物经电泳,切胶后,送公司纯化,测序,使用GCG软件分析GP120和tat基因氨基酸序列。结果1本研究共分离培养71株HIV-1原始毒株,经env和gag基因的检测分析,其中46株是B’亚型,样本来自于安徽,河南和山西;25株是B’C亚型病毒均来自新疆。通过流式细胞仪检测病毒辅助受体的使用,结果显示B’亚型利用CCR5受体为占67.4%(31/46),双嗜性即CCR5/CXCR4均阳性占32.6%(15/46),而25份B’C重组亚型毒株辅助受体利用均为CCR5(100%),无一例为双嗜性。不同亚型辅助受体利用率采用x~2检验,结果有显著性的差异(P＜0.001);辅助受体与CD4和病毒载量的关系,分析结果显示B’亚型毒株46株在CD4的不同范围均有分布(CD4＞200/ul,n=23;CD4 200-100/ul,n=9;CD4＜100/ul,n=14),双嗜性毒株的比例由CD4＞200/ul的13.04%增加到CD4＜100/ul的50%;分析辅助受体与VL关系的结果显示,当病毒载量＜10~3 copies/ml时,B’亚型病毒有11株,并且均利用CCR5为辅助受体;当病毒载量10~3--10~5 copies/ml之间有11株,72.72%利用CCR5为辅助受体(8/11),27.27%利用R5/X4为辅助受体(3/11);当病毒载量＞10~5;copies/ml有24株,54.17%利用CCR5为辅助受体(13/24),45.83%利用R5/X4双受体为辅助受体(11/24)。结果表明随着VL值的升高,B’亚型毒株辅助性受体利用R5/X4的比例由0逐渐升高到45.83%。对25株B’C重组病毒株的辅助受体利用结果发现,这些病毒的病毒载量在不同的范围均有分布(VL＜10~3 copies/ml,n=5;VL 10~3--10~5 copies/ml,n=5;VL＞10~5 copies/ml,n=15)但所有病毒辅助受体的利用均为CCR5。2本研究通过基因检测分析序列变化和表型的关系,其中20份是B’亚型,11例是B’C亚型。GP120 V3环序列分析B’亚型毒株V3顶端四肽有三种类型:GPGK、GPGQ、和GPGR,其中以GPGR所占比例最高为70%;12例B’C重组毒株V3顶端四肽全部为GPGQ(100%)。不同亚型V3环糖基化位点丢失率分析,20例B’亚型毒株有10%(2/20)N-糖基化位点的糖蛋白丢失,B’C亚型毒株无一例N-糖基化位点的糖蛋白丢失,两组的糖蛋白丢失率采用X~2检验,结果无显著性差异(p＞0.05);B’亚型毒株电荷数分布于3-6之间,B’C亚型毒株电荷数分布在2-5之间,不同亚型毒株的电荷数的分布和≥5的高电荷数的比例是不同的,采用T检验两组的电荷数是有显著性的差异(P＜0.05)。通过对11,25位点氨基酸分析结果显示B’亚型20%的毒株在11位点有改变,80%的毒株在25位点有改变,20%的毒株在11,25位点均有改变。相反B’C亚型毒株所有的序列在11,25位点均无改变3流式细胞仪对分离的B’C亚型与B’亚型毒株感染性的测定结果以均数±标准差表示,B’C亚型毒株的感染性(?)±SD为11.1154±8.1807,B’亚型R5/X4毒株的感染性(?)±SD为4.4991±3.62312,B’亚型R5毒株的感染性(?)±SD为5.0032±4.1502,各组感染性的比较采用T检验,统计学分析结果显示B’C亚型与B’亚型的R5/X4组及R5组比较均有有显著性差异(P均＜0.05)。B’C亚型毒株的感染性明显高于B’亚型的R5/X4组及R5组毒株的感染性。4 GP120不同亚型及不同区域糖基化位点的数目是不同的,与病毒感染性相关的区域是V1V2、V3及V3环的临近区域的糖蛋白的变化。V3环糖基化位点糖蛋白分析结果显示B’亚型毒株有10%N-糖基化位点的糖蛋白丢失,B’C重组毒株N-糖基化位点的糖蛋白没有一例丢失。GP120V1V2区糖蛋白比例分析,结果显示V1V2区的N130、N133、N136、N144、N160和N186位点,V3环临近区域氨基酸分析结果显示,C2区的N230、N234、N295和C3区的N362位点的糖蛋白比例两组比较有显著性的差异(p＜0.05)5复制动力学检测结果显示,B’亚型的R5及R5/X4毒株复制在第7天就明显的开始升高,复制水平达到5000pg/ml,第15天达到10000-15000pg/ml,而B’C亚型在第7天才缓慢上升,第10天接近5000pg/ml,第15天达到5000-10000pg/ml。B’C亚型的R5毒株与B’亚型的R5及R5/X4毒株复制有显著性变化是在第7、10、15天。第1、3、5天无统计学差异。通过比较不同亚型毒株的病毒载量的对数值,结果以均数±标准差表示,B’C亚型的VL(?)±SD是4.6991±1.4353,而B’亚型的R5/X4毒株(?)±SD为5.771±0.7752,R5毒株(?)±SD为5.6513±0.8364,B’C亚型毒株与B’亚型的R5/X4毒株和R5毒株的病毒载量的对数值比较有显著性的差异(P均＜0.05);6 Tat基因第一外显子氨基酸位点的变化频率C(第60-72位)端变化最大,疏水性核心区(第32-48位)和碱性区(第48-57位)有些变化。38-48位点是tat与cyclinl结合的关键部位,B’C亚型氨基酸在39和46位均发生了变化。Tat碱性区49RKKRRQRRR57九肽对其识别和与TAR RNA结合是必须的,B’C亚型毒株在50,54位和57位点的氨基酸均被其他的氨基酸取代,而B’亚型变异较小。由于这些位点的改变而影响了tat与TAR RNA结合而使B’C亚型的复制能力明显下降。结论1研究了HIV-1的主要流行株的生物学表型特征并探索了HIV-1在感染和传播过程中的变化规律。1.1 HIV-1 B’亚型毒株和B’C重组毒株使用的辅助受体是不同的。HIV-1 B’亚型毒株利用CCR5和R5/X4,而且R5/X4的比例随着CD4细胞计数的下降和病毒载量的升高而增加。说明B’亚型毒株在疾病进展过程中发生辅助受体利用的改变;B’C亚型毒株无论CD4和VL如何变化,病毒仅使用CCR5为辅助受体,在疾病进展过程中很少发生受体利用的改变。1.2 B’C亚型毒株表现为持续性使用CCR5受体,机体生理特点对R5毒株有选择的优势,因此R5毒株相对于X4毒株具有传播优势。体外感染性检测结果显示B’C亚型毒株的感染性明显高于B’亚型毒株的感染性,说明B’C亚型毒株自身的特点也决定了毒株融合进入细胞的能力强于B’亚型毒株。B’C亚型毒株持续性使用CCR5受体,机体对R5毒株具有的传播优势和病毒自身感染能力强的特点决定了B’C亚型毒株的高效传播能力,这与我国的流行病调查的结果相符合。1.3体外实验显示B’C亚型毒株的复制能力较B’亚型毒株明显减弱,体内通过分析不同亚型病毒载量的结果与体外病毒复制结果相符合。提示B’C亚型毒株感染后相对于B’亚型毒株可能疾病进展的缓慢。2发现HIV-1的多种遗传学因素与其致病性相关。2.1 GP120 V3环氨基酸的变化与病毒辅助受体的转换有密切的关系。V3环氨基酸序列分析结果表明B’亚型序列变异比较大,无论是V3环的顶端四肽、11,25位点氨基酸的改变、糖蛋白的丢失和V3环的净电荷数都有改变,而B’C亚型毒株表现V3环序列高度保守,B’C亚型毒株V3环序列的保守性及低电荷数为其持续使用CCR5受体奠定了基础。B’亚型毒株V3环氨基酸的改变可能导致病毒在疾病进展的过程中病毒辅助受体利用的改变。2.2基因分析结果表明B’亚型和B’C亚型毒株的GP120不同区域中包含的糖基化位点的数目存在不同。B’C亚型毒株V3环序列高度保守,保证了病毒的致病性。而B’亚型V3环序列的改变导致病毒适应性的下降就要通过V1V2其V3环的临近区域的糖蛋白的改变来弥补。V1V2及其V3环的临近区域的糖蛋白的改变可能影响了病毒的感染性的强弱。2.3 B’C亚型tat氨基酸关键位点39、46、50、54、57都有改变,而这些位点氨基酸的改变有可能降低病毒的复制能力,导致B’和B’C亚型毒株复制能力的差异。提示B’C亚型tat基因的改变与病毒的复制能力减弱,从而导致疾病进展的相对缓慢有关。总之,我们利用细胞学实验通过辅助受体,感染性和病毒复制动力的检测,从三个层次初步阐述了不同亚型毒株的生物学特性及其变化规律;利用分子生物学实验对相关区域基因序列分析探讨了不同亚型毒株分子生物学的差异,初步了解了影响病毒生物学差异的分子基础。影响病毒生物学的因素是复杂多样的,而且是相互作用。这些差异可能是导致病毒生物学特性改变的原因。