背景多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)作为最常见的内分泌代谢紊乱综合征之一,在育龄期女性中患病率约为6%-8%。其主要临床症状包括月经稀发/闭经、高雄表现、卵巢多囊样改变、肥胖等,由PCOS带来的不孕症占到了无排卵性不孕症的75%。除此之外,PCOS还会引起糖尿病、心血管疾病、子宫内膜癌等多种并发症,因此多囊卵巢综合征已经超越了妇产科领域,成为一种累及全身,影响终生的内分泌代谢疾病。多囊卵巢综合征具有显著的遗传异质性、表型复杂性的特点,其发病机制尚不明确。目前观点认为多囊卵巢综合征的病因包括遗传因素和以环境作用为主的非遗传因素。在遗传因素层面,我们研究中心之前进行了一系列研究,包括全基因组关联分析研究(GWAS)和基因的病例-对照研究,发现了多个与多囊卵巢综合征密切关联的基因及位点。虽然报道的位点被多项独立的研究所验证,但是很多基因都是初次被发现与多囊卵巢综合征相关,尚缺少足够的基础研究来揭示其在多囊卵巢综合征发病发展中的具体作用。亟待相关的基础实验来探究候选基因在多囊卵巢综合征发病中的作用,这也将为疾病进一步的预防、诊断和治疗奠定基础。本研究尝试探究多囊卵巢综合征单基因病例-对照研究发现的STMN1基因及GWAS研究发现的候选基因DENND1A在卵巢内分泌中的作用及其机制,进而尝试阐释其在多囊卵巢综合征病理生理中的作用。第一章:STMN1在颗粒细胞中的功能研究第一节STMN1在PCOS患者颗粒细胞中的表达变化研究目的:STMN1(Stathmin 1)作为一个在物种间高度保守的基因,编码一个定位于胞浆中的有诸多调节功能的蛋白分子,它参与到广泛的细胞信号通路中,比如控制细胞增殖、分化等。有研究发现STMN1在啮齿类动物的脑垂体及胰岛素瘤的激素分泌调节中发挥重要的作用;此外STMN1通过肿瘤坏死因子a参与到神经生长因子诱导的颗粒细胞凋亡中,而神经生长因子还可以通过促进类固醇合成酶的表达进而促进激素分泌细胞合成孕酮、睾酮及雌二醇的能力。诸多证据提示我们STMN1可能在性激素的分泌调控及生殖系统的相关疾病中发挥一定的作用,而我们关注的多囊卵巢综合征又存在睾酮、胰岛素等一系列激素合成分泌的紊乱。颗粒细胞作为重要的类固醇激素合成细胞,可以分泌雌激素、孕酮等多种激素及细胞因子,在正常生理周期的调节和妊娠过程中发挥重要的作用。目前为止,STMN1在颗粒细胞的具体功能研究也尚无报道,其是否参与到多囊卵巢综合征的发生发展中尚待研究。本节实验尝试探究STMN1在多囊卵巢综合征患者的颗粒细胞中是否存在表达的异常。方法:我们收集本中心(山东大学附属生殖医院)行IVF治疗的多囊卵巢综合征患者的卵泡液颗粒细胞标本38例及正常对照患者(因输卵管因素、男方因素等接受IVF治疗)的卵泡液颗粒细胞标本36例,提取total RNA并反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR的方法对STMN1的表达进行转录水平的检测。结果:转录水平上,STMN1在多囊卵巢综合征患者颗粒细胞中的表达量是正常对照患者颗粒细胞中表达量的2倍,且具有统计学差异。结论:STMN1在多囊卵巢综合征患者颗粒细胞中的表达量是显著升高的,其可能在多囊卵巢综合征的病例生理中发挥一定的作用。第二节 Stmn1在小鼠原代颗粒细胞中的功能研究目的:STMN1在多囊卵巢综合征患者颗粒细胞中的表达量显著升高,预示STMN1可能在颗粒细胞的功能中发挥一定的作用,而STMN1在卵巢诸多功能中(卵泡发育、卵母细胞的成熟以及卵巢的类固醇激素合成)的作用尚无具体的报道,本实验尝试探究STMN1是否影响颗粒细胞的类固醇激素合成。方法:我们使用小鼠和猴子的卵巢进行免疫组织化学的染色,研究STMN1在卵巢组织水平的定位;使用细胞免疫荧光的方法对基因的表达进行亚细胞水平的定位;在卵巢颗粒细胞中上调和下调基因后检测常见类固醇激素的合成改变;使用RTCA实时细胞增殖试验来检测基因对细胞增殖能力的影响;如果存在类固醇激素合成改变,在转录和翻译水平检测类固醇激素合成酶的表达变化;使用双荧光素酶报告基因方法检测其是否对类固醇合成相关酶的表达有调控作用。结果:我们发现在小鼠和恒河猴卵巢中,STMN1均在卵巢颗粒细胞中表达丰富,而且主要定位于胞浆中,在细胞核中也有一定表达。在小鼠原代颗粒细胞中,我们分别敲降/过表达STMN1后,发现STMN1可以影响颗粒细胞合成孕酮的能力:即下调STMN1后,小鼠颗粒细胞合成孕酮的能力降低;过表达STMN1后,小鼠颗粒细胞合成孕酮的能力增强。使用RTCA细胞增殖实时检测的方法发现敲降STMN1后,颗粒细胞的增殖能力没有发生明显改变;过表达STMN1后颗粒细胞的增殖能力出现了轻微的下降。对孕酮合成通路中关键基因进行检测,发现上调Stmn1后,通路中的Star和Cyp11a1的表达出现升高,而敲降Stmn1后,Star和Cyp11a1的表达降低。双荧光素酶报告基因检测发现,STMN1在小鼠原代细胞、HEK293T、KGN、SVOG细胞中均可以促进Star和Cyp11a1的表达活性。生物信息学的方法预测显示STMN1在Star的转录起始位点附近存在STMN1的结合位点,并且染色质免疫共沉淀的方法验证发现STMN1可以结合到Star-1(-1,196/-1,177),Star-3(+247/+269)及Star-(+71/+741)位点。结论:本研究中,我们发现STMN1在卵巢中主要表达于颗粒细胞中,并且能够改变颗粒细胞合成孕酮的能力,进一步的通路研究证实Stmn1可以通过增加类固醇合成限速酶Star的转录表达,相关研究结果将为临床实践提供诊断和治疗的思路和方向。第二章:PCOS候选基因DENND1A在卵巢颗粒细胞中的功能研究第一节DENND1A在卵巢中的表达定位研究目的:DENND1A与多囊卵巢综合征的相关性在我中心开展的GWAS研究中被首次发现,在DENND1A序列内发现rs10818854,rs2479106和rs10986105三个易感位点;并且,在欧美人群中进行的三项独立研究亦发现DENND1A与多囊卵巢综合征相关,强烈的证据表明DENND1A为多囊卵巢综合征的关键候选基因。但是DENND1A基因在卵巢中的功能研究并不充分:对于DENND1A在卵巢中的具体表达定位尚没有明确的结论,而具体的功能机制研究鲜见报道。我们首先对DENND1A进行了组织水平和细胞水平上的表达定位研究,尝试明确DENND1A在卵巢中的表达模式,对下一步功能的研究指明方向。方法:使用荧光定量PCR方法在多种组织中检测DENND1A表达水平;用免疫组织化学染色对DENND1A在卵巢组织水平上的表达进行定位;进而同时使用细胞免疫荧光的方法对DENND1A进行细胞水平的表达定位研究。结果:DENND1A转录本1及转录本2在全身组织中有不同程度的表达,其中转录本1在肝脏、睾丸、脾脏、胃、肠中有十分丰富的表达,而转录本2在睾丸、卵巢、肌肉、脾脏中表达十分丰富。卵巢组织切片的免疫组织化学染色显示,DENND1A主要表达于卵巢各级卵泡的颗粒细胞中,在膜细胞、卵母细胞中也有少量表达。使用KGN细胞进行的细胞免疫荧光的实验结果显示,DENND1A转录本1主要定位于细胞质中,而DENND1A转录本2在细胞质和细胞核中均有表达。结论:DENND1A转录本1及转录本2在全身组织中有不同程度的表达,在卵巢中其主要表达在卵巢颗粒细胞中。在细胞水平上,DENND1A转录本1和转录本2的表达位置稍有不同:转录本1只表达于细胞质中,而转录本2在细胞质和细胞核中均有表达。第二节DENND1A在PCOS患者颗粒细胞中的表达变化研究目的:多项研究发现DENND1A与多囊卵巢综合征密切相关,而我们上节的研究发现DENND1A在卵巢颗粒细胞中表达丰富。那么DENND1A是否参与到多囊卵巢综合征颗粒细胞功能异常中去呢?基因异常功能的实现需要异常的基因表达,比如在数量、质量、时间或空间等方面的异常。本节实验尝试探究DENND1A在多囊卵巢综合征患者的颗粒细胞中的表达是否存在异常。方法:我们收集了 109例于本中心(山东大学附属生殖医院)行IVF治疗的多囊卵巢综合征患者的卵泡液颗粒细胞标本及68例正常对照患者(因输卵管因素、男方因素等接受IVF治疗)的卵泡液颗粒细胞标本,提取total RNA并反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR的方法对DENND1A的表达进行转录水平的检测。结果:实时荧光定量PCR结果分析显示:以内参基因GAPDH的表达量为1的参考下,在PCOS患者的颗粒细胞中DENND1A转录本1的表达量为0.00355 ±0.00293(Mean±SD,下同),而正常对照患者颗粒细胞中转录本1的表达量为0.00241 ± 0.00117;DENN1A转录本2在PCOS患者颗粒细胞中的表达量为0.00087 ± 0.00107,而在正常对照患者颗粒细胞中的表达量为0.00050 ± 0.00042。即DENND1A转录本1及转录本2的表达量在多囊卵巢综合征患者的颗粒细胞中的表达是升高的,且具有显著性的差异。结论:我们发现多囊卵巢综合征患者颗粒细胞中DENND1A的表达量是显著升高的,提示其可能在颗粒细胞中发挥一定的作用,可能在多囊卵巢综合征的发生发展中发挥一定的作用。第三节DENND1A在卵巢颗粒细胞中的功能研究目的:在前两节实验中,我们证实了多囊卵巢综合征候选基因DENND1A在卵巢颗粒细胞中表达丰富,并且其在多囊卵巢综合征患者的颗粒细胞中的表达水平是升高的,提示我们DENND1A可能在颗粒细胞中发挥一定的作用。到目前为止,尚没有DENND1A在卵巢颗粒细胞中的功能研究报道,本节实验尝试探究DENND1A在颗粒细胞中的可能作用。方法:我们使用具有内分泌功能的人卵巢颗粒细胞细胞系--KGN细胞,分别通过构建稳转细胞系来上调DENND1A或通过转染特异siRNA来敲降DENND1A,检测上调和下调后,细胞分泌的类固醇激素的改变,同时检测DENND1A基因对KGN细胞增殖能力的影响。如果存在类固醇激素合成改变,进而在转录和翻译层面检测相关类固醇合成酶的表达变化。同时,我们设计构建了在颗粒细胞中特异性表达的基因Cyp19a1的启动子驱动表达的Dennd1a过表达的转基因小鼠模型,研究转基因小鼠的生育力相关表型。结果:我们在实验中构建了稳转细胞系,发现稳定过表达DENND1A.转录本1及转录本2的KGN细胞培养上清中的雌二醇(E2)的水平是上升的,而使用siRNA在KGN细胞系中分别对DENND1A转录本1及转录本2进行敲降后发现,细胞上清中的E2水平均是降低的。进一步的类固醇合成通路研究发现CYP19A1的表达受到DENND1A转录本1及转录本2的调控:上调DENND1A转录本1及转录本2后,发现CYP19A1在mRNA和蛋白水平的表达量都是上升的;而敲降DENND1A转录本1及转录本2后,CYP19A1在mRNA和蛋白水平的表达量都是降低的。体内实验发现:Dennd1a转基因小鼠的在基础状态下卵巢中的卵泡发育呈现过度激活的状态,后期卵泡的发育过程出现异常,成熟的窦卵泡数量减少。结论:在KGN细胞系中,DENND1A的转录本1及转录本2可以通过介导CYP19A1的表达进而促进KGN细胞合成E2的能力,并且能够促进KGN细胞的增殖。特异性在卵巢颗粒细胞中过表达Dennd1a的转基因小鼠的卵泡存在过度的激活,卵泡的发育存在障碍。