研究目的帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是第二大最常见的神经变性疾病,特征表现为进行性运动障碍,包括静止震颤,肌强直,运动迟缓,和步态不稳等症状。当前全球大约有700万人患有帕金森病。在中国,帕金森病的患病率在65岁以上人群中大约是2.05%。帕金森病给社会和患者家庭带来巨大的经济和生活负担。据报导,在美国每名帕金森病患者每年的医疗费用大概在10,000美元。除了经济成本,帕金森病的运动和非运动症状都大大降低PD病人及其照顾者的生活质量。帕金森病的确切病因尚不清楚。帕金森在大多数患者都是特发性的。帕金森病的已知病因包括遗传,环境因素等,或者是两者的共同作用。流行病学研究表明,帕金森病患者中仅有不足10%与家族遗传因素相关,而超过90%的PD患者都是散发的。目前,帕金森病尚缺乏有效的治疗手段。可得的治疗方案大多为对症治疗,包括补充左旋多巴,多巴胺激动剂和MAO-B抑制剂等。但这只能缓解症状,并不能阻断或逆转疾病的发展。帕金森病的主要病理变化包括多巴胺能神经元变性,Lewy体形成和纹状体多巴胺减少等,这些病理变化的共同特征是慢性、渐进性、不可逆的改变。正常人中,大脑黑质区多巴胺能神经元随着人体老化过程也会有少量减少,大约不超过10%-15%,但并不会出现帕金森病症。大部分PD患者被确诊时,多巴胺能神经元的损失已经达到60%以上。对于帕金森病的疾病进展过程的研究,虽然黑质纹状体通路仍然是主要焦点,但随着病人尸检结果和MRI技术应用等,早有研究表明,中脑-皮质,皮质-边缘通路在疾病进程中也发挥了重要作用。除了多巴胺能神经元投射系统,胆碱能神经元,γ-氨基丁酸能神经元,和去甲肾上腺素能神经元投射系统也发生明显病理改变,包括神经元减少、Lewy体形成及神经递质减少等。2003年,德国病理学家Braak博士根据其在病人标本和尸检中α突触核蛋白染色等结果,提出著名的Braak“黑匣子理论”,认为PD不仅是运动障碍疾病,一系列的非运动症状在疾病早期,运动症状出现之前,即已发生,同时伴随有自脑干向中脑、皮质区自下而上发生神经元退行性变。Braak理论一经提出,就引起同行专家的广泛关注,帕金森病的发病起点、疾病进展因素、运动症状前非运动症状(包括嗅觉减退、胃肠功能失调、睡眠紊乱、焦虑-抑郁病症等)成为帕金森病研究新的关注焦点和研究方向。多项研究证实,帕金森病疾病进展中,脑干区域蓝斑核(Locus Coeruleus, LC)的去甲肾上腺素能神经元(Norepinephrine, NE)损失发生明显早于中脑黑质区域(Substantia Nigra, SN)的多巴胺能神经元,时间差大约要早10-15年。而且,蓝斑核神经元的减少很可能与帕金森病人的运动症状前出现的非运动症状有关,包括嗅觉减退、焦虑-抑郁症状、胃肠功能紊乱、睡眠障碍等。然而,对帕金森病早期阶段的病理改变和非运动症状的进一步研究一直停滞不前,原因是缺乏一个可利用的有效的动物模型。我们实验室先前的研究已经建立一个神经炎性诱导的帕金森病模型,该模型可以模拟帕金森病中黑质区多巴胺能神经元的慢性、渐进性病理改变和运动症状的延迟性、进展性出现。该小鼠模型是利用细菌内毒素腹腔注射,引起全身炎性反应,血液中高浓度的肿瘤坏死因子TNF-a被携带进入大脑,引起小胶质细胞的激活和持续性反馈激活,从而引起神经元变性死亡和疾病发生。然而,我们知道,帕金森病的神经元变性和症状改变已经不仅仅限于黑质致密部多巴胺能神经元的变性和运动障碍的出现。确定其他相关脑区,蓝斑核、海马、前皮质区神经元的改变也至关重要。因此,在本研究中,我们不仅观察黑质区多巴胺能神经元的改变,焦点更主要在炎性模型是否能够模拟帕金森病中实际发生的自下而上多个脑区渐进性神经元的变性和死亡。并试图由此揭示最早发生神经元变性的蓝斑核去甲肾上腺素能神经元在疾病进展中所扮演的角色。因此,该课题在细菌内毒素诱导的帕金森病神经炎性模型中,我们最早观察脑干区蓝斑核去甲肾上腺素能神经元的改变,这对于帕金森病的早期诊断和治疗具有重要意义。本项研究的主要目的为,确定炎症介导的啮齿动物帕金森病模型是否可以模拟帕金森病人中发生的自下而上渐进性神经元变性死亡和运动、非运动症状的出现,阐明蓝斑核去甲肾上腺素在疾病进展中的作用,并揭示发生这一慢性渐进性神经元变性的细胞和分子机制。我们的研究假设是,较早发生的蓝斑核去甲肾上腺素能神经元变性死亡启动和促进了帕金森病的发生和进展。我们的研究的目标包括：1)确定炎症介导的啮齿动物PD模型中是否发生自下而上、有序的渐进性神经元的缺失,尤其是蓝斑核去甲肾上腺素能神经元；2)确定较早发生的蓝斑核去甲肾上腺素能神经元死亡和去甲肾上腺素缺失是否与其投射区的神经元变性死亡有关；3)建立一个合适的帕金森病模型能够同时出现帕金森病的运动和非运动症状；4)阐明蓝斑核去甲肾上腺素如何调节炎症介导的神经退行性病变的机制。5)根据以上研究结果,发展新的帕金森病靶向治疗方案。研究方法1.小鼠动物模型：根据不同实验目的设计实验方案,6-8周龄雄性C57BL/6小鼠腹腔注射LPS (5 mg/kg.bw)或DSP-4 (50 mg/kg.bw)或先后联合注射。在设定的时间点(分别在注射之后的第1,2,4,7,10,12个月),从各组取5-8只小鼠实施安乐死,并取出大脑后固定在4%多聚甲醛中4℃过夜。然后大脑置于30%蔗糖/PBS溶液中4℃保存,直至大脑下沉到容器的底部。作冠状切面冰冻切片,收集含蓝斑核的脑干,含黑质、海马的中脑,以及大脑皮质区的35μm厚度组织切片。2.免疫组织化学染色：用4-10%山羊血清和1%BSA在triton-100/PBS溶液中封闭,然后与多克隆兔抗TH抗体(1：2000-5000稀释),或NeuN抗体(1：1000稀释度)4℃下作用48小时。使用Vectastain ABC试剂盒和二氨基联苯胺基染色显示细胞或免疫荧光染色共聚焦显微镜观察细胞形态和病理改变。3.细胞计数：在黑质致密部TH免疫反应(THIR)神经元的数目是由立体计数系统软件进行统计。该软件使用系统地随机化的黑质区域定义的边界之内无偏计数帧(100微米×100微米)的光学分馏方法计数估算。经DAB染色的NeuN免疫反应性神经元和Iba-1小胶质细胞或经免疫双荧光染色的神经元或细胞是由ImageJ软件进行自动计数。4.脑组织中神经递质检测：大脑皮质,海马,尾壳核,中脑和脑干中去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺等神经递质及其主要代谢物的含量水平经高效液相色谱(HPLC)进行检测。5.大脑各区炎症因子或标志蛋白：mRNA含量检测：应用实时定量PCR进行冰冻组织中炎症因子或标志蛋白mRNA含量检测,简言之,用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取和收集大脑皮质,海马,尾壳核,中脑和脑干组织中mRNA,并经反转录为cDNA,使用SYBR green PCR混合液进行标记,应用7900HT快速实时PCR系统根据制造商的方案进行实时PCR扩增。6.帕金森病小鼠模型中运动和非运动症状行为学改变的检测：在DSP-4/LPS注射后12个月的时间点,从每个组(生理盐水对照,DSP-4单独,DSP-4+LPS,和LPS单独)中随机选出8只小鼠,进行运动和非运动行为学的测试。运动行为学测定包括倒挂网格试验,加速转棒试验,旷场试验,以及步态障碍分析。非运动症状行为学的测试包括嗅觉功能测试,高架十字迷宫焦虑测试,一小时粪便收集便秘测试,惊厥反应测试,以及Morris水迷宫学习记忆功能测试。7.神经-胶质细胞原代培养体系建立：培养体系的建立,简言之,无菌操作下取出胎龄13/14天的Fischer 344大鼠或12/13天C57BL/6J和NADPH氧化酶基因敲除(CYBB)小鼠的胚胎,在解剖显微镜下分离出腹侧中脑,然后轻柔地机械吹打,以破碎组织。4℃离心以除去组织细胞碎片,弃上清液,加入细胞培养液,计数重悬后的细胞并接种到多聚赖氨酸(20mg/ml)预包被的24孔培养板(5×I05/0.5m1培养液/孔)或96孔培养板(1×105/0.2m1培养液/孔)中。细胞培养在含5%二氧化碳和95%空气的饱和湿度的37℃恒温培养箱中。细胞培养7天用于处理时,免疫化学染色定量分析显示神经-胶质细胞混合培养体系的细胞组成应为：10%为小胶质细胞,50%为星形胶质细胞,40%为神经细胞,在总神经细胞中,2.5-3.5%为多巴胺(dopamine, DA)能神经元。8.细胞系：本研究中使用到转染NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX2)的猴肾COS7-PHOX和COS7细胞系。大鼠小神经胶质细胞系HAPI也在本研究中应用。9.多巴胺能神经元功能检测：[3H]多巴胺摄取测定法用于原代神经胶质细胞培养体系中多巴胺能神经元的功能评价。简言之,将细胞置于含浓度为1μM[3H]多巴胺的Krebs-Ringer缓冲液中37℃温育21分钟。之后将细胞用冰冷的Krebs-Ringer缓冲洗三次,然后收集在1NNaOH中。放射性浓度通过液体闪烁计数定量。10.炎症因子的测定：一氧化氮(NO)含量通过测定上清液与Griess试剂反应产生亚硝酸盐的累积水平决定。细胞上清液中肿瘤坏死因子α (TNF-α)的测定经TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒测定。细胞外超氧化物的测量是采用SOD抑制WST-1还原的原理与方法,简言之,用温的汉克氏平衡盐溶液(HBSS)清洗培养板中的纯小胶质细胞或神经-胶质细胞混合培养体系2次后,每孔加入50 ul溶解在HBSS中的不同处理的药物,37℃孵育30分钟,再分别加入50μl溶解在HBSS中的刺激物(如LPS),最后加入100μl溶解在HBSS中的160mM WST-1(含或不含SOD,250 U/每孔)。在分光光度仪上(450nm)读取光密度值。超氧化物的产量是30分钟时吸收度的增加值,其结果表示为对照组的百分比。11.胞膜胞浆分离和Western blot分析：小胶质细胞在低渗裂解缓冲液裂解,然后进行匀浆。将裂解物在1600×g转速下离心15分钟,上清液在100000×g离心30分钟。在1%的Nonidet P-40的低渗溶胞缓冲液中重悬,将细胞膜成分和胞浆成分分离,并进行Western blot分析。12.血液分析：氯氮平或氯氮平-N-氧化物的第一次注射后21天,对小鼠进行安乐死,眼球血液收集在1.5ml肝素管。充分混匀后,不同类型的血细胞的数量经由自动血细胞计数器进行计数。13.统计分析：所有的组数据表示为平均值±SEM。统计分析使用单向或双向ANOVA把给药作为独立变量进行比较。当ANOVA呈显著差异时,使用Dunnettpost hoc检验组间差异。统计分析使用GraphPad Prism版本6.00,设定双面α 0.05进行统计分析。研究结果1.LPS注射引起小鼠自脑干至皮质,自下而上发生有序的、渐进性的神经元变性死亡。1.1在LPS诱导的神经炎性帕金森病小鼠模型中,蓝斑核去甲肾上腺素能神经元减少早于黑质致密部多巴胺能神经元减少3-4个月。单次腹腔注射LPS在C57BL/6小鼠后,蓝斑核去甲肾上腺素能神经元最先发生减少,4个月注射LPS后LC-NE神经元损失达30%,神经元减少持续进行,10个月可达52%。随后,中脑黑质区多巴胺能神经元在第7个月时发生明显减少,10个月时减少32%。同样的结果在人类A53T转基因小鼠中得以证实。A53T转基因小鼠在LPS腹腔注射1个月即发生蓝斑核神经元损失,而多巴胺神经元损失发生在3个月以后。这符合帕金森病人实际中发生的,循序渐进性神经元的变性死亡规律。1.2由LPS注射引起小鼠处脑干至皮质,自下而上发生的有序的、渐进性的神经元变性死亡。单次腹腔注射LPS在C57BL/6小鼠后,继蓝斑核去甲肾上腺素能神经元最先发生减少和中脑黑质区多巴胺能神经元减少之后,10个月时,中脑以上的海马、皮质区也相继发生神经元的变性死亡。总之,我们研究结果证明,炎症介导的小鼠帕金森病模型可以模拟帕金森病人表现出的自下而上,从脑干到皮质的神经元渐进性退行性变的病理改变过程。1.3蓝斑核去甲肾上腺素缺失增强LPS炎性反应引起的黑质多巴胺能神经元减少。在C57BL/6小鼠单次腹腔注射LPS 6个月之后,腹腔注射4次DSP-4(50mg/k),时间间隔为每两周一次。DSP-4诱导蓝斑核去甲肾上腺素缺失,促使LPS炎性反应引起的黑质多巴胺能神经元减少增至50%,与LPS单独组的30%相比增加了20%。2.蓝斑核-去甲肾上腺素耗竭促进肾上腺素能神经元投射区神经元的退行性变和死亡。2.1蓝斑核-去甲肾上腺素耗竭引起投射区发生自下而上有序、渐进性神经元退行性变。蓝斑核-去甲肾上腺素由DSP-4注射耗尽后,首先在黑质致密部发现了延迟性和进展性的多巴胺能神经元减少,4个月时减少32.4%,这种减少持续发展,到第10个月时减少49.9%。另外,通过DSP-4诱导的神经变性随后也延伸到皮质和海马。NeuN免疫组织化学染色显示,在DSP-4给予第10个月时,海马和皮质的神经元减少分别达到30.0%和27.7%。值得注意的是,对于没有去甲肾上腺素能神经元投射的尾壳核进行免疫染色观察神经元是否受到影响,发现整个过程直至第10个月时,该区域的神经元稳定存在,未受DSP-4耗竭去甲肾上腺素的影响。2.2由DSP-4注射引起的去甲肾上腺素耗竭促使蓝斑核去甲肾上腺素能神经元投射区小胶质细胞发生持续活化。为了探索去甲肾上腺素耗竭引起投射区神经元变性死亡的原因,我们分别使用Iba-1和CD11b两个小胶质细胞胞浆和胞膜的特异性标志物抗体检测去甲肾上腺素能神经元投射区(包括黑质、海马、皮质)小胶质细胞的激活情况。结果显示,在所有这些去甲肾上腺素能神经支配的大脑区域,在DSP-4给予后的第7天时,小胶质细胞即表现出明显活化特征,包括阿米巴样肥大形态和Iba1、CDllb染色加深、表达升高,并且小胶质细胞的这些激活状态一直持续至第10个月。DSP-4处理导致的黑质、海马(DG区)、皮质小胶质细胞的激活,表现为CD11b染色密度的升高,以密度定量,与对照相比,第7天时,可增高至153.5%至193.8%,10个月时,升高至-250%。与此不同,对于没有去甲肾上腺素能神经元投射的尾壳核进行免疫染色观察小胶质细胞是否受到影响,发现整个过程直至第10个月时,该区域的小胶质细胞并无激活改变,未受DSP-4耗竭去甲肾上腺素的影响。2.3 dbh基因敲除诱导蓝斑核去甲肾上腺素能神经元投射的大脑区域神经元变性和小胶质细胞激活。为了进一步验证NE缺乏可引起神经功能障碍和神经炎症反应,我们在dbh基因敲除的小鼠中检测神经元和小胶质细胞的改变。dbh是去甲肾上腺素合成的关键酶,dbh基因敲除将完全阻滞NE的合成。结果跟DSP-4耗竭NE引起神经退行性变相似,与野生型相比,dbh基因敲除产生的NE枯竭同样引起蓝斑核投射区(黑质、海马、皮质)神经元的减少和小胶质的持续激活,并且神经元减少和小胶质细胞激活在未有LC-NE投射的尾壳核区并不发生。3.去甲肾上腺素耗竭促进LPS炎性介导的帕金森病小鼠模型同时出现运动和非运动行为学改变。3.1提前注射DSP-4促使去甲肾上腺素耗竭导致LPS炎性帕金森病模型中,黑质、海马和皮质区神经元变性和死亡增多。提前一周给予DSP-4注射以耗竭蓝斑核去加肾上腺素的合成,再给予LPS引起帕金森病炎性模型,可发现,在注射12月以后,与单独给予LPS的组别相比,DSP-4和LPS双重打击可增加蓝斑核投射区神经元的变性死亡(包括黑质、海马、皮质区)。3.2去甲肾上腺素提前耗竭促使LPS诱导的神经炎性帕金森病模型中出现多种符合帕金森病人中运动症状出现之前的多种非运动症状。与盐水对照或LPS单独给予组相比,DSP-4和LPS双重打击可以诱导小鼠帕金森病炎性模型中出现多种类似帕金森病人运动前症状的行为学改变,包括埋藏食物探索实验得出的嗅觉减退,梯形十字架迷宫实验得出的焦虑抑郁症状,一小时粪便试验中表现出的便秘胃肠功能紊乱等。3.3去甲肾上腺素提前耗竭促使LPS诱导的神经炎性帕金森病模型中出现多种帕金森病相关运动行为学改变。与生理盐水对照组相比,DSP-4或/和LPS注射小鼠在倒挂网格试验、加速转棒实验中表现出潜伏期明显缩短,旷场试验中边缘移动时间和距离明显减少。在自主行动步态检测中,DSP-4和LPS双重打击小鼠出现步态紊乱症状,表现为步幅缩短、后肢间距拉大,步态角度变宽、足外翻、拖步行动、自由活动受限等。3.4去甲肾上腺素提前耗竭促使LPS诱导的神经炎性帕金森病模型中出现小鼠惊恐反应。在DSP-4和LPS注射12个月之后,与生理盐水对照组相比较,小鼠表现出明显前脉冲抑制和惊恐反应增强。而在LPS或DSP-4单独暴露组,并无此反应。结果表明,DSP-4和LPS合并暴露促进帕金森病人中易出现的惊恐反应的发生。3.5去甲肾上腺素提前耗竭促使LPS诱导的神经炎性帕金森病模型中小鼠认知能力下降。在DSP-4和LPS注射12月之后,行Morris水迷宫实验发现,与生理盐水对照组相比较,DSP-4,LPS或DSP-4+LPS处理小鼠出现认知障碍以及学习记忆能力下降。4.突触外旁分泌的低浓度去甲肾上腺素通过调节小胶质细胞免疫活性发挥抗炎和神经保护作用。4.1在原代培养的神经胶质混合培养体系中,亚微摩尔浓度水平去甲肾上腺素保护多巴胺能神经元免受LPS诱导的神经毒性损伤。[3H]多巴胺摄取试验表明,去甲肾上腺素预处理可以重塑多巴胺能神经元的功能,并在10-6-10-9浓度范围内呈现剂量反应关系。多巴胺能神经元经THIR抗体免疫组织化学染色细胞计数的结果进一步证明,去甲肾上腺素预处理可以逆转LPS诱导的多巴胺能神经元毒性损伤和数量减少,在10-6-10-9浓度范围内呈现剂量反应关系。除了恢复多巴胺能神经元的数量,NE减少了炎症介导的神经毒性相关的多巴胺能神经突起退缩和退化。两者合计表明,去甲肾上腺素对LPS诱导的多巴胺能神经毒性具有保护作用。4.2小胶质细胞在低浓度去甲肾上腺素保护多巴胺能神经元免受炎性损伤中必不可少。在神经胶质细胞的混合培养体系中,NE(10-7M)有效逆转MPP+诱导的[3H]DA摄取减少,可恢复20%,但当去除该体系中的小胶质细胞时,这一保护作用消失。这表明,去甲肾上腺素介导的多巴胺神经保护需要小胶质细胞的存在,提示去甲肾上腺素可能是通过抑制小神经胶质细胞的激活而发挥作用。4.3低浓度去甲肾上腺素可以降低LPS诱导的小胶质细胞活化,并减少促炎因子的释放。经Iba-1抗体对小胶质细胞的特异性免疫细胞化学染色结果表明,LPS暴露后24小时,与对照组相比,小胶质细胞明显激活,表现为胞体肥大、分枝和凸起增多,Iba-1表达升高,但是去甲肾上腺素预处理组小胶质细胞的激活明显受到抑制(与LPS组相比),小胶质细胞多处于胞体小、凸起少的静息状态。Iba-1染色的细胞计数结果也进一步证实激活状态的小胶质细胞明显少于LPS组。除了形态学观察,去甲肾上腺素预处理抑制了活化的小胶质细胞促炎因子的释放,表现为与LPS相比,TNF-α,一氧化氮和超氧化物的产生均明显降低和减少,并在10-6-10-9浓度范围内呈现剂量反应关系。4.4β2去甲肾上腺素能受体部分参与介导低浓度去甲肾上腺素的抗炎和神经保护作用。与野生型(wild type,WT)相比,p2去甲肾上腺素能受体基因敲除(β 2-AR-/-)可以部分逆转去甲肾上腺素对LPS诱导的TNF-α释放的抑制作用,但不能完全逆转,这提示可能另有其他信号通路同时参与介导了去甲肾上腺素的抗炎作用。与此同时,中脑神经胶质细胞混合培养体系中,[3H]多巴胺摄取量的测定也证实,去甲肾上腺素的神经保护作用仅部分受β2去甲肾上腺素能受体基因敲除的抑制。LPS引起[3H]多巴胺摄取量在WT和β2-AR-/-中都降低为50%,但在WT中,去甲肾上腺素预处理可以逆转至80%,而β2-AR-/-中只有65%。4.5低浓度去甲肾上腺素依赖于NOX2抑制LPS诱导的超氧化物的产生,并不受p2去甲肾上腺素能受体影响。在LPS处理的混合胶质细胞培养体系中,(+)-NE和(-)-NE两种形式的去甲肾上腺素可同等程度抑制LPS诱导的超氧化物的产生。因为(+)-NE与受体的亲和力远低于(-)-NE,这提示去甲肾上腺素抑制超氧化物的产生并不通过作用于受体的途径。在COS7-PHOX细胞系中,这一结果被进一步证实,(+)-NE和(-)-NE两个异构体可以同等程度抑制佛波脂(phorbol myristate acetate,PMA)诱导COS7-PHOX细胞系产生超氧化物。此外,在WT和β2-AR-/-的混合胶质细胞培养体系中,(+)-NE和(-)-NE两个异构体去甲肾上腺素对LPS引起的超氧化物的抑制作用相当。提前将去甲肾上腺素其他非特异性G蛋白偶联受体α1或β1受体分别经酚妥拉明和普萘洛尔阻断,对NE抑制LPS诱导超氧化物产生也无影响。综合表明肾上腺素的所有特异性和非特异性的G蛋白偶联受体,均没有参与调解NE抑制超氧化物产生的作用。4.6低浓度去甲肾上腺素抑制LPS诱导p47phox蛋白由胞浆到胞膜的转运。HAPI小胶质细胞系的Western blot分析结果表明,LPS处理可以显著降低p47phox蛋白在胞浆的含量,同时其在胞膜的含量增加,但是去甲肾上腺素预处理可以有效的抑制p47phox蛋白这种由胞浆到胞膜的转运,p47phox胞浆到胞膜转运是NOX2活化的必须反应步骤,这一结果提示去甲肾上腺素可以抑制NOX2的活化,从而抑制超氧化物的产生。4.7 NOX2介导低浓度去甲肾上腺素独立于β2肾上腺素受体的抗炎/神经保护作用。为了确定NOX2是否为除β2肾上腺素受体之外,介导低浓度去甲肾上腺素抗炎/神经保护效应的作用靶点,我们将NE对NOX2的抑制作用与NOX2的特异性抑制剂DPI相对比,发现NE与DPI相同程度抑制TNF-α产生和提升[3H]多巴胺摄取能力的作用,而且两者同时存在时没有叠加效应而是相互竞争。除此之外,在NOX2基因敲除的神经胶质细胞培养体系中同时经ICI-118,551完全阻断去甲肾上腺素能受体的作用时,去甲肾上腺素的抗炎和神经保护作用就完全被阻滞。这些数据表明,NOX2是除β2肾上腺素受体之外,介导低浓度去甲肾上腺素抗炎和神经保护作用的另一唯一靶点。4.8 NOX2特异性抑制剂(DPI)干预可以减少小鼠大脑中由于去甲肾上腺素耗竭引起的小胶质细胞活化。C57BL/6小鼠在给予DSP-4阻滞蓝斑核分泌去甲肾上腺素后,第4天可以明显观察到蓝斑核去甲肾上腺素能神经元的投射区(包括黑质区)小胶质细胞的活化,但是NOX2特异性抑制剂DPI干预可以抑制小胶质细胞的活化,表现为与DSP-4组相比,小胶质细胞的特异性CD11b抗体染色密度降低。5.氯氮平代谢产物(CNO和NDC)通过作用于小胶质细胞NOX2抑制其活化保护多巴胺能神经元免受炎性损伤。5.1在神经胶质细胞的混合培养体系中,氯氮平代谢产物(CNO和NDC)保护多巴胺神经元免受LPS诱导的神经毒性损伤。CNO或NDC预处理保护多巴胺神经元免受LPS诱导神经元损伤,表现为对[3H]多巴胺摄取能力的重塑和降低多巴胺能神经元数量的减少,并呈现凸形剂量反应关系。CNO和NDC最有效的浓度分别为0.01μm和0.1μm。5.2小胶质细胞在CNO和NDC的神经保护作用中至关重要。在神经胶质细胞的完全混合培养体系中,CNO和NDC都对神经炎性诱导的多巴胺能神经元损伤具有明显的保护作用,但当在培养体系中撤除小胶质细胞时,这些保护作用也随之消失,说明小胶质细胞是CNO和NDC发挥有效神经保护作用的靶点细胞。对小胶质细胞的免疫组织化学特异性抗体Iba-1和CD11b染色和Western bot定量结果表明,CNO和NDC可以有效抑制小胶质细胞的活化。进一步对TNF-α和NO等炎性因子的检测表明,CNO和NDC可以有效抑制小胶质细胞活化产生的炎性因子的释放。5.3 CNO和NDC的抗炎和神经保护作用的关键靶点是小胶质的NOX2。来源于NOX2基因敲除的小鼠的神经胶质细胞混合培养体系中,CNO和NDC的抑制炎症因子产生和重塑神经元[3H]多巴胺摄取能力的作用均被阻滞。在HAPI小胶质细胞系的Western blot分析中,CNO和NDC可以有效抑制LPS诱导的p47phox蛋白从胞浆到胞膜的转运。综合结果表明,CNO和NDC可以通过作用于NOX2抑制小胶质细胞的激活。5.4 CNO减弱MPTP诱发的多巴胺能神经元的损伤和运动障碍,且不显示中性粒细胞毒性。MPTP注射诱导的小鼠帕金森病模型中,在第14天时,小鼠出现明显的运动障碍,表现为加速转棒实验潜伏期的缩短43%。同时实验结束,第21天时对多巴胺神元的染色和计数结果表明,多巴胺神经元大约减少50%。但是CNO与氯氮平治疗可以明显改善小鼠的运动障碍和多巴胺能神将元的减少,表现为使转棒潜伏期恢复到85%,多巴胺能神经元的减少降到28%。氯氮平的临床应用因为其中性粒细胞毒性而受到限制,因此在体实验中,我们同时检测氯氮平和CNO是否引起中性粒细胞减少,结果显示与母体化合物氯氮平相比,CNO长达连续21天的治疗对嗜中性粒细胞无任何毒性,表现为全血样品中白细胞的数量没有改变。5.5 CNO抑制MPTP诱导的小胶质细胞反应性激活。在MPTP处理的小鼠,小胶质发生活化,特征表现为胞体肥大、分枝增多,黑质区CDllb染色密度增加。与MPTP单独组相比,氯氮平和CNO治疗可以显着抑制小胶质细胞活化,降低CD11b染色的密度。结论1.在炎性介导的小鼠帕金森病模型中,蓝斑核的去甲肾上腺素能神经元减少相比黑质致密部多巴胺能神经元的减少要早3-4个月。2.蓝斑核去甲肾上腺素耗竭引起大脑中肾上腺素能神经元投射区神经元发生自下而上有序的、渐进性、慢性进行性神经退行性变。3.较早发生的蓝斑核去甲肾上腺素耗竭促使炎性介导的帕金森病小鼠模型中出现帕金森病人中的多种运动和非运动症状的神经行为学改变。4.突触外旁分泌的去甲肾上腺素通过作用于小胶质细胞起到神经免疫调节作用。5.突触外旁分泌的去甲肾上腺素发挥抗炎和神经保护作用时,除传统的G蛋白偶联受体β2-AR外,发现有一个全新的作用靶点,即小胶质细胞的NOX2。6.通过作用于小胶质细胞NOX2抑制其激活,氯氮平代谢产物CNO和NDC可以有效保护多巴胺神经元免受炎症毒性损伤。