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目的:嗜麦芽窄食单胞菌(SMA)广泛存在于自然界,在污水、自来水、土壤、人类体内均有寄居,医院环境如透析装置、氧气湿化罐、血压计、人工呼吸装置、通气管道、医务人员皮肤等也都能分离到该菌。嗜麦芽窄食单胞菌为条件致病菌,由于其致病力低,临床上一直未引起重视。近年来,随着广谱抗生素和介入性诊疗技术的广泛应用,该菌感染率不断上升,已成为继铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌之后的又一重要非发酵革兰阴性杆菌,它的临床致病性越来越受到重视。嗜麦芽窄食单胞菌作为院内感染病原菌,在医院环境中的传递模式目前尚不清楚,分子流行病学是调查菌株间流行关系的有力工具,在分子分型方法中,脉冲场凝胶电泳(PFGE)被认为是基因分型方法中的金标准,因此应用PFGE调查嗜麦芽窄食单胞菌分子流行病学特征,必将揭示菌株在医院内的传播方式,为控制其流行和传播提供更为有效的措施。
嗜麦芽窄食单胞菌具有外膜低渗透性,抗生素难以通过细菌外膜进入细胞内以及泵出机制等,故对多种抗生素呈天然耐药性。此外,该菌可产生超广谱β内酰胺酶(ESBL)相金属β内酰胺酶(MBL),故呈现出包括碳青霉烯类药物在内的多重耐药性。临床实验室标准委员会(CLSI)把复方磺胺甲噁唑作为治疗嗜麦芽窄食单胞菌的首选药,尽管复方磺胺甲噁唑体外药敏实验抑菌效果敏感,但临床应用很快产生耐药性,其他药物如左氧氟沙星单独应用也易产生耐药,因此推荐联合用药,但是关于联合药敏的抗菌效果体外报道不一,国内未见喹诺酮类抗生素联合β内酰胺类抗生素对嗜麦芽窄食单胞菌体外联合效应的报道。
近年来耐复方磺胺甲噁唑嗜麦芽窄食单胞菌的报道逐渐增多,但耐药比率报道不一,大概在2~15%,总体上正表现为逐年增高的趋势。有关嗜麦芽窄食单胞菌耐复方磺胺甲噁唑的机制国外正处于研究的热点,已有研究认为Ⅰ类整合子增强嗜麦芽窄食单胞菌对复方磺胺甲噁唑的耐药性,整合子作为可移动的基因,可以通过质粒或转座子传播,成为目前细菌耐药机制的研究的热点,但是国内未见有关嗜麦芽窄食单胞菌对复方磺胺甲噁唑耐药机制的报道。整合子通过整合酶的作用可以整合自然界中的耐药基因,被整合的基因盒通过整合子广泛传播,成为细菌耐药的重要机制。嗜麦芽窄食单胞菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性被认为是固有耐药,目前发现的两个耐药基因都位于染色体上。整合子携带的耐氨基糖苷类基因盒已经在沙门菌属和假单胞菌属中有报道,但是未见有关整合子携带的基因盒导致嗜麦芽窄食单胞菌耐氨基苷类的报道。
嗜麦芽窄食单胞菌作为一种重要的医院内病原菌,消毒和灭菌是控制其引起医院感染的重要手段。随着消毒剂的广泛使用,由于细菌长期暴露于浓度日渐增高的消毒剂环境中,逐渐产生染色体或质粒的变异,所获得遗传物质编码的耐药性可得以稳定遗传,从而引发严重的临床感染。细菌对消毒剂的抗性机制研究不多,抗性机制尚不清楚。
因此本研究旨在通过分子流行病学的手段,揭示菌株在医院内的传播方式;探讨嗜麦芽窄食单胞菌对复方磺胺甲噁唑和氨基糖苷类抗生素的耐药机制,明确整合子在嗜麦芽窄食单胞菌耐药性传播中的重要地位;探讨嗜麦芽窄食单胞菌对消毒剂的耐药机制及传播机制;并通过联合药敏的手段旨在探索新的治疗方案,为控制嗜麦芽窄食单胞菌在医院内的出现和传播提供充分有力的理论依据。
方法:采用病例回顾的方法分析了2004~2007年临床分离的165株株嗜麦芽窄食单胞菌的临床相关资料,探讨临床感染的相关危险因素。
采用脉冲场凝胶电泳技术对18株连续临床分离株和8株耐消毒剂的菌株的染色体进行基因分型,并应用quantity one软件分析同源性,条带相关性90%以上的被认为同一基因亚型。
采用微量肉汤稀释法检测8种抗生素对165株嗜麦芽窄食单胞菌的最小抑菌浓度;采用棋盘格稀释法,分别测定头孢他啶与左氧氟沙星、头孢哌酮/舒巴坦与左氧氟沙星联合应用时最小抑菌浓度(MIC),并根据公式计算部分抑菌浓度指数(FIC),根据FIC指数判断是否有协同效应。
应用基因扩增技术扩增sul1,int1,aac(6)-Ⅰ,aac(6)-Ⅱ,ant(2")-Ⅰ等基因。扩增阳性产物测序并与GenBank比对。碱裂解法提取质粒后作为模板,基因扩增。
采用滤膜结合法质粒接合转移试验探讨耐消毒剂基因的转移机制。
结果:嗜麦芽窄食单胞菌医院感染以肺部感染为主,占全部病例的87.9%。患者使用呼吸机、泌尿道插管、动静脉插管等比率为61.8%;合并感染菌以铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、念珠菌为主;有124例患者合并其他部位医院感染,占总感染例数的75.2%。选择2007.4至2007.7收集的18株临床连续分离的嗜麦芽窄食单胞菌进行基因同源性,共得到了17个基因型,采用quantity one软件分析基因同源性,结果表明条带4和5有100%的同源性,条带2和9有95%的同源性,追踪临床资料表明4和5同在RICU,而2和9的患者分别来自EICU和RICU,结果说明在RICU病房有同一克隆株的传播,在RICU和EICU不同病房也有同一克隆株的传播。
左氧氟沙星与头孢他啶联合应用,FIC范围主要在0~1以协同和相加为主,无拮抗作用,FIC在0.5以下比例占56.7%,以协同为主;左氧氟沙星与头孢哌酮/舒巴坦联合应用,FIC范围主要在0~1以协同和相加为主,无拮抗作用,FIC在0.5~1之间的比例为占53.3%,以相加为主。
应用肉汤稀释法共检测13株菌耐复方磺胺甲噁唑,通过E-test方法进一步确证共有12株耐药,耐药率为7.8%。12株耐药的菌株中,sul1基因阳性8株,占66.7%,而48株敏感的菌株中,sul1基因均阴性;Ⅰ整合子的阳性株为8株,阳性率为13.3%。
60株嗜麦芽窄食单胞菌中扩增aac基因,aac(6)-Ⅱ基因阳性4株,阳性率为6.7%,ant(2")-Ⅰ基因阳性3株,阳性率为5%,aac(6)-Ⅰ基因阳性2株,阳性率为3.3%。对aac(6)-Ⅱ基因阳性4株,应用intl的上游引物与aac(6)-Ⅱ的下游引物为扩增引物,结果2株在1000bp有阳性产物,2株菌在500bp有阳性产物;产物测序后证明aac(6)-Ⅱ位于Ⅰ类整合子上。为了明确氨基糖苷类修饰酶基因的位置,进一步了解其传播机制,提取质粒后,扩增以上阳性基因,结果所有基因都阳性,说明耐氨基糖苷类基因存在于质粒上。
60株嗜麦芽窄食单胞菌中qacE△1基因扩增结果,有8株阳性,阳性率13.3%。8株qacE△1基因阳性的菌株质粒接合试验成功3例。对8株菌进行基因同源性分析,共有6个基因型的分布,采用quantity one软件分析同源性,表明条带1和条带5有93%的同源性,条带3和条带8有90%的同源性,追踪临床资料表明病例1和5同在呼吸科,而3和8的患者也来自呼吸科,但是分别位于呼吸科普通病房和RICU,结果说明在呼吸ICU病房和普通病房有相似克隆株的传播。
结论:
1.嗜麦芽窄食单胞菌引起的感染以肺部感染为主,与感染有关的因素包括年龄、基础疾病、住院时间、侵入性治疗设施的应用等,同一克隆株的出现说明此菌有在医院内有引起流行的趋势。
2.左氧氟沙星与β内酰胺类药物联合主要以协同或相加为主,抗生素联合应用将成为临床治疗嗜麦芽窄食单胞感染的有效措施。
3.整合子已成为嗜麦芽窄食单胞菌耐复方磺胺甲噁唑耐药性中的重要组成部分。aac(6)-Ⅰ和ant(2")-Ⅰ及aac(6)-Ⅱ基因的出现,补充了有关嗜麦芽窄食单胞菌天然耐氨基糖苷类的机制,证实耐氨基糖苷的基因不但存在染色体上,而且存在于质粒上。
4.质粒接合试验成功和同源性分析证实了消毒剂基因的传播方式,进一步完善了消毒剂耐药性传播的分子机制。