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研究背景:全球范围内结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,位居肿瘤患者死亡原因第四位,且其发病率呈上升趋势。结肠癌易发生肝转移,这是导致患者预后不良和死亡的首要因素。因此,探讨结肠癌侵袭和转移发生的分子机制十分必要。microRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的长度为19-25个核苷酸的单链非编码小RNA分子,通过降解靶mRNA或抑制其翻译,在细胞增殖、分化、代谢和死亡等多种生物学过程发挥调控作用。研究发现,miRNAs还可作为肿瘤抑制基因或癌基因而参与肿瘤的发生及转移过程。microRNA-140-5p(miR-140)是一种在软骨中特异性表达的微小RNA,其表达下调与骨关节炎发病有关。近来的研究显示miR-140还参与了肿瘤发生和发展过程。有报道miR-140在包括结直肠癌、肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、食管癌、胰腺癌、胆管癌、骨肉瘤、下咽鳞癌和神经胶质瘤等多种肿瘤中低表达,抑制肿瘤细胞迁移和侵袭能力,起到肿瘤抑制因子的作用。此外,miR-140可抑制乳腺癌和结肠癌干细胞形成。但也有研究发现,mi R-140在神经胶质瘤从II级发展至IV级的进程中表达升高。还有报道miR-140在乳腺癌侵袭性导管癌和发生转移的组织中高表达,在乳腺癌进展和转移过程中发挥促进作用。因此,miR-140在肿瘤进展和转移中的作用尚存在一些争议,其潜在的机制仍不清楚。研究已证实,含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样锌离子依赖的分泌型金属蛋白酶-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS5)和胰岛素样生长因子结合蛋白-5(insulin like growth factor binding protein 5,igfbp5)是mir-140的直接靶点。adamts5升高表达与脑恶性胶质瘤、喉鳞状细胞癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌(headandnecksquamouscellcarcinoma,hnscc)和nsclc的进展相关。igfbp5与前列腺癌、乳腺癌、结肠癌的发生有关,高表达能够促进乳腺癌进展。但adamts5和igfbp5在结肠癌侵袭和转移方面的作用尚未见报道。目的:(1)探讨mir-140在结肠癌侵袭和转移中的作用及机制。(2)adamts5和igfbp5在人结肠癌组织中的表达及临床病理意义。方法:(1)采用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测人结肠癌组织和邻近癌旁结肠组织中mir-140水平,结合临床病理资料分析mir-140表达与包括结肠癌分期和远处转移等在内的临床病理变量的关系。(2)将mir-140模拟物(mir-140)和无关序列(nc)、mir-140特异性抑制物(anti-mir-140)和无关序列(anti-nc)以及针对adamts5和igfbp5的sirna(分别为siadamts5和siigfbp5)等通过脂质体lipofectamine2000转染至人结肠癌hct116和rko细胞。(3)应用qrt-pcr检测hct116和rko细胞中mir-140以及adamts5和igfbp5mrna水平,应用westernblot检测adamts5和igfbp5蛋白表达。(4)采用划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测mir-140对结肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。(5)免疫组织化学方法检测60对人结肠癌组织和邻近癌旁结肠组织中adamts5和igfbp5蛋白表达,分析adamts5和igfbp5表达与结肠癌发生、发展和远处转移等的相关性。结果:(1)mir-140在人结肠癌组织中的表达水平显著低于邻近癌旁结肠组织(p=0.037),且mir-140表达与结肠癌分期(p=0.045)和远处转移(p=0.031)呈负相关,而与患者年龄、性别、肿瘤大小和组织分化程度无关(p值均>0.05)。(2)westernblot结果显示,mir-140组中adamts5和igfbp5表达显著低于空白对照组(control)和nc组(p值均<0.05),而与阳性对照siadamts5和siigfbp5组相比则无显著差别(p值均>0.05)。qrt-pcr结果显示,mir-140组中adamts5和igfbp5mrna水平也显著低于control和nc组(p值均<0.05)。(3)细胞划痕实验结果显示,与control和nc组比,mir-140组结肠癌细胞迁移能力显著减弱,而与siadamts5和siigfbp5组相比无显著差异。transwell迁移实验(无基质胶包被)结果显示,在结肠癌hct116细胞中,mir-140组穿膜细胞数(63.7±4.5)显著低于Control组(103.2±3.5)和NC组(107.5±6.1,P值均<0.05),而与siADAMTS5组(58.9±3.8)和siIGFBP5组(57.8±2.6)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。同样地,在结肠癌RKO细胞中具有类似效应。Transwell侵袭实验(基质胶包被)结果显示,HCT116细胞中miR-140组穿膜细胞数(54.6±2.9)明显少于阴性对照组(91.2±6.1或89.6±3.9,P值均<0.05),siADAMTS5组(45.2±2.3)和siIGFBP5组(47.9±3.6)与miR-140组相似。此外,在结肠癌RKO细胞中具有相似的结果。miR-140下调可使ADAMTS5和IGFBP5表达增高,并可部分逆转miR-140对细胞迁移和侵袭能力的抑制作用,mi R-140抑制剂和ADAMTS5和IGFBP5 siRNA共转染则对ADAMTS5和IGFBP5蛋白表达以及细胞迁移和侵袭能力无明显影响。(4)ADAMTS5和IGFBP5在人结肠癌组织中表达增高,其过表达与结肠癌分期(P值分别为0.041和0.037)和远处转移(P值分别为0.027和0.021)呈正相关。结论:(1)mi R-140可在转录后水平负调控ADAMTS5和IGFBP5表达。(2)miR-140可能通过下调ADAMTS5和IGFBP5表达而抑制结肠癌细胞迁移和侵袭能力。(3)miR-140低表达以及ADAMTS5和IGFBP5高表达与结肠癌进展和转移有关。miR-140可能成为结肠癌治疗的潜在候选靶点。