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杏花雨注射液是新研制的银杏叶提取物注射液,提取物中黄酮苷含量为49.79%,萜烯为4.4%。已有许多文献报道黄酮类化合物有较好的抗肿瘤活性,杏花雨注射液中含有丰富的黄酮类物质,含量居各类物质之首。因此,其在抗肿瘤方面可能具有很大潜力。本实验旨在通过研究杏花雨注射液及其含药血清对人乳腺癌MCF-7/S的抑制作用,并初步研究杏花雨注射液对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/A耐药性的逆转及其作用机制,从而为其更好的应用于临床提供客观而科学的依据。目的:观察杏花雨注射液及其含药血清对人乳腺癌MCF-7/S抑制作用,并初步探讨杏花雨注射液对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/A耐药性的逆转及其作用机制。方法:⑴含药血清的制备:SD大鼠20只随机分为两组。一组杏花雨注射液腹腔注射,1ml/100g,1次/d;另一组生理盐水腹腔注射,1ml/100g,1次/d,连续3d。最后一次注射后半小时,麻醉、采血、提取血清。⑵MTT法测定杏花雨注射液对人乳腺癌细胞MCF-7/S生长的影响:取细胞培养于96孔培养板内,培养24 h后,给药组加入5个不同浓度的杏花雨注射液,溶剂对照组加入与给药组等体积的培养基。3d后用Fluo-star在检测波长570 nm条件下测定光密度值(OD value),计算药物对细胞的抑制率。⑶MTT法测定含药血清对人乳腺癌细胞MCF-7/S生长的影响:MCF-7/S细胞分为ADM对照组、含药血清组、正常大鼠血清对照组,每组设6个平行复孔,分别加入ADM 4μg/ml、5%的含药血清、10%的含药血清、15%的含药血清、正常的SD大鼠血清。3d后,用Fluo-star在检测波长570 nm条件下测定OD值,计算药物对细胞的抑制率。⑷杏花雨注射液逆转肿瘤细胞耐药的研究:MTT法检测杏花雨注射液的细胞药敏性和耐药倍数,确定生长率>95%的药物浓度为非细胞毒性浓度,生长率85%~90%的药物浓度为低细胞毒性浓度。同时计算IC50。耐药倍数=耐药细胞的IC50/敏感细胞的IC50。MTT法检测细胞药敏性和耐药性的逆转:实验分四组:①不同浓度的ADM单独作用于敏感细胞;②不同浓度的ADM单独作用于耐药细胞;③不同浓度的ADM与非细胞毒性浓度的杏花雨注射液作用于耐药细胞;④不同浓度的ADM与低细胞毒性浓度的杏花雨注射液作用于耐药细胞。同前方法测定各孔OD值,计算各组IC50,求出各组耐药细胞的逆转倍数。激光共聚焦显微镜观察:对数生长期细胞接种于24孔板,每孔1ml。次日,给药组分别加入非细胞毒性浓度的杏花雨注射液+ADM和低细胞毒性浓度的杏花雨注射液+ADM,对照组加入RPMI1640培养液+ADM。24 h后弃上清,PBS洗一次,激光共聚焦显微镜下观察并定量。⑸杏花雨注射液逆转肿瘤细胞耐药性作用机制的研究:Western-blot检测肿瘤细胞p-gp糖蛋白的表达。结果:⑴用不同浓度杏花雨注射液(22、44、88、175和350 mg·L -1)处理MCF-7/S细胞3 d,对细胞的增殖抑制率分别为:2.50%,6.25%,8.72%,18.72%,26.63%,与空白对照组相比杏花雨注射液22、44、88、175 mg·L -1不能明显抑制MCF-7/S细胞的增殖(P>0.05),350 mg·L -1可显著地抑制MCF-7/S细胞的增殖(P<0.05)。⑵用ADM、5%含药血清、10%含药血清、15%含药血清分别处理人乳腺癌MCF-7/S细胞3 d,对MCF-7/S细胞的抑制率分别为91.21%、7.46%、19.36%和27.54%,与正常对照组比较,10%和15%含药血清对MCF-7/S细胞的抑制效应显著(P<0.01),但抑制效应不如ADM(P<0.01)。⑶杏花雨注射液对MCF-7/A、MCF-7/S的IC50分别为(189.95±115.89)mg/L及(177.52±81.24)mg/L,耐药倍数为1.07倍,提示MCF-7/A细胞对杏花雨注射液无耐药性。ADM对MCF-7/A及MCF-7/S的IC50分别为(0.78±0.21)mg/L和(0.042±0.011)mg/L,耐药倍数为18.57。非细胞毒性浓度杏花雨注射液和低细胞毒性浓度杏花雨注射液使MCF-7/A细胞的IC50明显降低为(0.42±0.18)mg/L、(0.37±0.097)mg/L,逆转倍数分别为1.87倍和2.12倍,提示杏花雨注射液能显著降低MCF-7/A细胞的IC50(P <0.05)⑷只加ADM的对照组的荧光强度为(34±7),非细胞毒性浓度杏花雨注射液联合ADM组的荧光强度为(76±11),低细胞毒性浓度杏花雨注射液联合ADM组的荧光强度为(118±25)。与对照组相比,杏花雨注射液能够明显增加细胞内ADM的浓度(P <0.01)。⑸通过Western-blot检测发现杏花雨注射液能够下调p-gp糖蛋白的表达,阴性对照组、维拉帕米组、低细胞毒性浓度组、非细胞毒性浓度组的光密度值/β-actin分别为0.364±0.061,0.316±0.078,0.159±0.036,0.214±0.021,与阴性对照组相比杏花雨注射液可显著下调p-gp糖蛋白的表达(P <0.01)。结论:⑴杏花雨注射液及其含药血清能够显著地抑制MCF-7/S细胞的生长。⑵杏花雨注射液可以显著逆转多药耐药细胞MCF-7/A的耐药性。