研究目的:术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是手术后中枢神经系统的并发症。根据流行病学研究的数据,在心脏手术中POCD的发生率在20%～79%之间,在非心脏手术中POCD的发生率为4.1%～22.3%。POCD的发生与死亡率升高、患者住院时间延长、医疗费用增加和生活质量降低密切相关。对于POCD目前尚无特别有效的疗法。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,在近期的临床和基础研究中DEX被认为有神经保护作用。现有少量研究认为DEX对POCD可能有效,但作用机制尚不明确。代谢对于神经功能至关重要,在近些年代谢越发受到关注。术前存在的代谢疾病是POCD术前的危险因素。而代谢组学作为系统生物学中的一种新兴方法,在研究疾病的机制中运用得越来越多。尚无从代谢角度研究DEX对POCD小鼠脑代谢产物的影响的研究。本研究的目的是探讨DEX是否改善POCD小鼠认知功能,并利用代谢组学对代谢物进行研究,根据组学结果结合数据库构建互作网络,寻找关键蛋白和可能的潜在机制,最后通过体外实验进行相关验证。研究方法:1.构建POCD模型,通过行为学检查观察DEX对POCD小鼠的认知功能的影响根据小鼠体重随机分为Control组(n=12)、Surgery组(n=12)和DEX+Surgery组(n=12)。Surgery组和DEX+Surgery组通过剖腹探查术在12个月龄老年C57 BL/6小鼠上构建POCD模型。DEX+Surgery组在手术结束时腹腔注射DEX(25ug/kg)。Control组不做任何处理。通过Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)和旷场实验(open field test,OFT)进行行为学检测。在术后第1天到第5天每天进行4次MWM隐蔽平台实验学习平台空间位置,在术后第6天进行OFT实验,在OFT结束30min后进行MWM空间探索实验。2.探讨DEX对POCD小鼠海马组织代谢物的影响通过代谢组学研究DEX对POCD小鼠海马组织影响。根据分组获取小鼠新鲜的海马组织,预处理样本后,在LC-MS平台上,用C18色谱柱检测差异代谢物。用Compound Discoverer软件对LC-MS检测数据进行提取和预处理,并在Excel 2010中对数据进行归一化及后期处理,将处理后的数据矩阵导入SIMCA-P 13.0软件进行多元统计分析。本研究中用到的多元统计分析包括主成份分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)、正交偏最小二乘法判别分析等(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA),通过分析,探讨不同样本间及不同分组间代谢物和代谢通路的差异。将Surgery组-Control组、DEX+Surgery组-Surgery组对比正负离子模式下得到的差异物质输入到在线数据库IPA中,根据各代谢物构建差异物质的互作网络。3.探讨DEX通过鞘氨醇激酶1(sphingosine kinases,SPHK1)抑制小胶质细胞炎症反应中的作用基于第二部分研究差异代谢物、富集到的代谢通路及互作网络结果所提示的鞘脂代谢及代谢中的限速酶SPHK1可能在代谢物变化中发挥重要作用,而小胶质细胞既是SPHK1的主要来源,又在POCD的发生中有重要作用,因此我们提出假设右美可能通过SPHK1抑制小胶质细胞炎症反应。在本部分实验中进行验证。1)首先确定DEX剂量对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠小胶质细胞系BV2细胞的影响。体外复苏培育BV2,用LPS(100ng/ul)和不同剂量DEX(0.1μM、1μM、5μM、10μM、50μM和100μM)同时刺激细胞,6h后收集上清,ELISA测炎症因子IL-6、TNF-α水平,根据结果确定DEX的剂量。2)确定DEX对LPS刺激BV2细胞分泌炎症因子m RNA水平的影响。体外复苏培育BV2细胞,用LPS(100ng/ul)和DEX(10μM)同时刺激细胞,1h收收集细胞总RNA,RT-PCR检测TNF-α和IL-6的m RNA表达水平。3)确定DEX对LPS刺激BV2细胞SPHK1的影响。体外复苏培育BV2细胞,用LPS和DEX同时刺激细胞,1h收收集细胞总RNA,RT-PCR检测SPHK1的m RNA表达水平;另一批6h后收集细胞总蛋白质行Western blotting,检测SPHK1的蛋白水平。4)用SPHK1激动剂激活SPHK1,观察DEX对炎症因子的影响。体外复苏培养BV2细胞系,用LPS(100ng/ul)、DEX(10μM)、SPHK1激动剂(MHP10μM)同时刺激细胞,6h后收集上清,ELISA测定上清中炎症因子TNF-α和IL-6的水平。结果:1.构建POCD模型,观察DEX对POCD小鼠的认知功能的影响隐蔽平台实验的结果中,Surgery组小鼠比Control组小鼠游泳距离延长,潜伏期延长,反应Surgery组更慢、更晚熟悉环境,记得平台位置,提示通过剖腹探查构建POCD模型成功。DEX+Surgery组小鼠比Surgery组小鼠游泳距离缩短,潜伏期缩短,反应DEX+Surgery组比Surgery组可以更快、更早熟悉环境,记得平台位置,提示DEX改善POCD小鼠术后学习能力。空间探索实验的结果中,Surgery组小鼠比Control组小鼠穿台次数减少,反应Surgery组小鼠对平台记忆不准确不牢靠,提示通过剖腹探查构建POCD模型成功。DEX+Surgery组小鼠比Surgery组小鼠穿台次数增加,反应DEX+Surgery组比Surgery组对平台的记忆更加准确牢固,提示DEX改善了POCD小鼠空间记忆能力。旷场实验结果提示3组小鼠自发行为上没有差异,可以排除焦虑、抑郁等因素对水迷宫实验结果的影响。2.探讨DEX对POCD小鼠海马组织代谢物的影响代谢组学研究共纳入Control组海马组织样本12例,Surgery组海马组织样本12例和DEX+Surgery组海马组织样本12例。Control组vs Surgery组和DEX+Surgery组vs Surgery组两对PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析表明,组间分离趋势明显。Surgery组和Control组的差异性表达代谢物正离子模式下有18种,负离子模式下有13种。DEX+Surgery组和Surgery组的差异性表达代谢物正离子模式下有17种,负离子模式下有9种。通过代谢物和代谢通路分析及互作网络构建,综合分析发现了SPHK1作为鞘脂代谢的限速酶与多个差异代谢物和MAPK、NF-κB多等条信号通路发生紧密联系。3.探讨右美通过SPHK1抑制小胶质细胞炎症反应中的作用在BV2中,LPS组的TNF-α和IL-6水平显著增加,10μM、50μM和100μM的DEX处理组的TNF-α水平较LPS组明显降低(p<0.01),0.1μM、1μM和5μM的DEX处理组较LPS组无明显变化,1μM、5μM、10μM、50μM和100μM的DEX处理组的IL-6水平较LPS组明显降低(p<0.01),0.1μM的DEX处理组较LPS组无明显变化,说明DEX对LPS诱导的TNF-α和IL-6的释放有抑制作用呈剂量依赖性,同时确定在下步的实验中右美处理的浓度选为10μM。在BV2中,LPS组的TNF-α和IL-6的m RNA水平显著增加,10μM的DEX处理组的TNF-α和IL-6水平较LPS组明显降低在BV2中,LPS组的SPHK1的m RNA和蛋白水平显著增加,10μM的DEX处理组的SPHK1水平较LPS组明显降低在BV2细胞中,与LPS组相比,DEX处理组的TNF-α和IL-6水平降低,而激活SPHK1后,LPS+DEX+MHP组的TNF-α和IL-6水平较LPS+DEX组升高。结论:右美托咪定可以改善POCD小鼠的学习能力、空间记忆能力,同时不影响小鼠自发行为。右美托咪定治疗导致海马区的代谢物发生显著差异。在BV2细胞中,右美托咪定可以抑制SPHK1,也发挥抗炎作用,激活SPHK1可逆转右美托咪定对炎症反应的抑制作用。提示DEX抑制小胶质细胞炎症反应可能与抑制SPHK1相关,减轻神经炎症,改善小鼠术后认知功能障碍。