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CD4+CD25+T细胞又称作天然调节性T细胞(natural regulatory T cell, nTreg),可限制效应应答的强度,另一方面,也可限制由过强抗感染免疫应答所带来的组织损伤。新近的研究显示,转录因子叉头框P3(forkhead box P3, Foxp3)被鉴定为nTreg发育和功能的主要调节器,也是nTreg迄今最特异的标志。因此,建立检测Foxp3’快速、特异的方法尤为重要。根据猪Foxp3基因和大肠杆菌的密码子偏爱性,优化并合成基因序列。在靶序列中,GC含量被调整到57.58%,不利基因表达的结构被去除,密码子适应指数从0.60上升到0.88,靶序列的异源表达水平被提升。PCR扩增的靶序列被克隆到原核表达载体pET-28a(+)后,将产物转化入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中。通过限制性酶切和测序,阳性克隆的质粒被鉴定并且与所需序列相一致。约48KDa的融合蛋白被IPTG诱导表达后,纯化得到高纯度的蛋白。通过用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔,得到抗猪Foxp3的兔抗血清。最后一次免疫后,ELISA测得抗血清的效价约为1：64000；免疫印迹分析显示,抗血清能特异性地识别靶蛋白。Protein G亲和层析纯化抗血清得到IgG. SDS-PAGE结果证明,纯化后的IgG由一个49.5KDa的重链和一个26.9KDa的轻链组成。用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。杂交瘤上清用间接ELISA筛检特异性抗体。获得五株杂交瘤细胞2A4、2C4、3F3、4C8及4C11,能稳定地培养并分泌抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体。所有单克隆抗体的Ig型均为IgG1,κ。腹水和上清的ELISA效价分别为3.2×105、1.6×105、3.2×105、1.28×106、6.4×105和4.0×103、1.0×103、8.0×103、4.0×103、2.0×103。ELISA和免疫印迹显示,五株单克隆抗体均能与外周血淋巴细胞中的猪Foxp3和融合蛋白反应。SDS-PAGE的结果证明,纯化的IgG由一个49.5KDa的重链和一个26.9KDa的轻链组成。研究了检测猪Foxp3蛋白的间接夹心ELISA,并通过试剂稀释优化了试验条件。纯化的单克隆抗体和多克隆抗体被用作包被抗体和检测抗体,其最优浓度分别是1.25μg/mL和0.9375μg/mL。酶标抗体的最优稀释比例为1/6000。试验中各反应成分不存在交叉反应。最低检测浓度为0.458ng/mL.量效曲线的线性范围为117.19-7.32ng/mL.用最小二乘法证明OD值与Foxp3浓度间的简单线性相关性,关系为OD=0.0106[Foxp3]+0.1387,决定系数为0.9981。批内和批间变异系数分别为4.89%和14.26%。根据临床症状收集样品,分为有病组和无病组,两组都是正态分布,有病组和无病组的样本量、平均值和标准差分别为17、108.82、85.77和27、167.54、89.97。单因素方差分析显示两组差异显著(p＜0.05)。本研究成功地制备了抗猪Foxp3的单克隆抗体和多克隆抗体,并构建了检测猪Foxp3的间接夹心ELISA,为进一步研究猪的Foxp3和nTreg提供了有利的手段和工具。