棉花是重要的经济作物,同时棉花作为盐碱地的“先锋作物”具有较强的抵御盐害能力。尽管如此,近年由于耕作区划调整和环境气候影响,对棉花耐逆能力的需求越来越高。以棉花耐盐优势为基础,揭示其耐盐机理,不仅有利于培育棉花耐盐品种,同时对其它作物的耐盐机制和育种具有重要参考意义。本研究通过转录组测序和SNP芯片分析从转录组、转录后剪切组和基因组等不同层面对棉花的耐盐机制进行了探究。主要研究结果如下:1.将二倍体耐盐野生品种戴维逊氏棉植株培养至两叶一心期,使用200mMNaCl进行盐胁迫处理。选取盐胁迫条件下5个不同时期根和叶组织,利用二代测序技术进行转录组分析。相比较已释放的雷蒙德氏棉基因组参考序列,在戴维逊氏棉中共发现了 43219个基因,其中6173个为新基因。盐胁迫下的差异表达分析显示,与对照相比,棉花根和叶中分别产生了 4744和5337个差异表达基因。基因功能注释结果显示,差异表达基因主要涉及植物胁迫应答、代谢和光合等进程。从不同组织不同时期差异表达基因的数目来看,这些盐胁迫应答基因的表达具有明显的时空特异性。根据盐处理后不同时间段差异表达基因数目和功能分类,棉花的盐胁迫应答进程主要分为两个部分,即胁迫前期(12-24 h)和胁迫后期(48-144h)。棉花根在胁迫前期,有着强烈的生理应答反应,渗透调节剂、离子运输、抗氧化酶以及大量的转录因子等相关基因在此阶段差异表达。而在后期,差异表达基因数目逐渐减少,各生理进程与常规处理相比无明显变化,表现出已经对盐胁迫耐受的现象。而在叶中,胁迫前期仅发现少部分和渗透胁迫相关的基因差异表达,随着胁迫时间的推移,离子运输和氧化还原等基因的表达逐渐活跃。在胁迫后期,大量基因呈现差异表达,不仅涉及胁迫应答相关基因,也包括各类植物生长发育代谢相关的基因,例如激素、碳水化合物、油脂等。另外,该阶段大量光合作用进程相关的基因也表现出下调表达,暗示在长期的盐胁迫条件下,植物的能量代谢和正常的生长发育均受到严重的影响。通路分析显示,在盐诱导下,SOS(Salt overly sensitive)和 ROS(Reactive oxygen species)途径中的关键基因十分活跃。SOS途径在维持离子平衡中起着重要的作用。与大部分研究表明植物主要以SOS3-SOS2-SOS1途径实现细胞内Na+外排的研究结果相比,本研究并未检测到SOS3的差异表达,而一个和SOS3相同功能的SCaBP8却在盐胁迫下高表达。推测在棉花中可能主要以SCaBP8-SOS2-SOS1信号途径来调控Na+外排,进而实现离子平衡。另外,我们还发现大量K+运输相关的基因,如HKT1,KUP1和KUP2等,在盐胁迫下差异表达,表明在棉花中,活跃的K+运输对维持细胞K+/Na+离子比,降低Na+毒害作用起着重要的作用。因此,棉花在维持离子平衡方面,主要通过两个途径,即Na+外排和K+积累。另外ROS途径在戴维逊氏棉盐胁迫应答进程中也占据着重要的地位。在盐胁迫环境下,大量ROS的产生会对植物细胞各组分产生严重损害。在本研究中,检测到大量的抗氧化酶基因,如GST、GRX、POD和CAT等上调表达,表明它们在棉花抗氧化进程中起着重要作用。2.在转录水平研究的基础上,进一步对盐胁迫下戴维逊氏棉的转录后剪切组进行了分析。戴维逊氏棉中共检测到6798个基因发生了 14172次可变剪切事件,涉及31.58%的多外显子基因发生了可变剪切。分别对组织间和胁迫间的剪切事件进行统计发现,5069个剪切事件为根叶共有,5035和5893个事件分别为根叶特有;8271个剪切事件为对照和胁迫共有,3618和4108个事件为对照和胁迫特有。研究发现大多数的剪切事件在不同生态型、不同组织和不同胁迫环境下存在明显的差异,表明剪切调控对基因多样性起着重要的作用。在盐胁迫下,无论根和叶组织中,可变剪切的数目均诱导增加,导致这两个组织中的基因亚型数目上升。为了探究胁迫诱导的剪切事件对功能基因产生的影响,我们通过fisher精确检验对显著受到诱导的差异剪切事件进行鉴定,分别在根和叶中发现了 1287和1228个差异剪切事件。对盐胁迫诱导的差异剪切基因进行功能分析发现,多数基因和植物胁迫应答进程相关,同时光合相关进程在叶中也被富集。表明盐胁迫诱导发生差异剪切的基因主要作用于植物的胁迫应答,预示盐胁迫下剪切事件的功能特异性。另外,受剪切的基因中,Ca2+应答进程也被显著富集。推测Ca2+信号通路中的许多基因更容易受到盐胁迫条件下的剪切调控,同时这些受到频繁剪切的基因对植物盐胁迫应答起着重要的作用。作为剪切调控的调节因子,我们在戴维逊氏棉中发现了 29个编码SR蛋白的拟南芥同源基因,其中13个在盐胁迫条件下发生了差异剪切。而在戴维逊氏棉表达谱中,只有2个编码SR蛋白的基因差异表达,表明其更容易受到剪切调控。已有报道表明,包括SR蛋白在内的大量剪切因子,存在一个调节与自我调节的过程。这种调节机制大大丰富了剪切因子的多样性,进而提高了剪切事件的多样性,最终导致植物基因亚型的多样性。通过对不同组织和时期的差异剪切事件分析,我们发现剪切事件具有很高的时空敏感性,很少有剪切事件长时间多组织的持续差异剪切。剪切调控是在转录产物基础上的进一步调控,其对基因功能的影响受限于基因转录丰度。它是对转录调控的二次微调,表现为温和多样。在植物应对不同逆境时,这种微调不会对植物造成强烈的伤害,而是在不断的调整中逐渐适应环境。有研究表明,在动物或植物长期的进化过程中,可变剪切的多样性逐渐增加。综上所述,剪切调控对植物的适应性进化具有十分重要的作用。3.本研究同时从基因组层面对植物的耐盐机制进行了分析。基于100余份不同来源陆地棉材料的重测序信息,研发了覆盖全基因组、适宜于陆地棉种基因型鉴定的高多态SNP芯片(CottonSNP80K芯片)。芯片包含了 77774个SNP位点,其中在A和D 亚组分别有 45183(58.10%)和 32591(41.90%)个位点。使用 CottonSNP80K 芯片对352份棉花样本进行SNP分型,59502(76.51%)个位点表现出多态性,57071(95.91%)个位点最小等位基因频率(MAF)大于0.05。通过22份样本对芯片质量进行评估,结果进一步证明该款芯片具有良好的分型效果,适用于陆地棉遗传多样性和分子育种等研究。结合本研究室对288份不同来源陆地棉材料的耐盐性分析,开展了陆地棉全基因组耐盐位点的GWAS(Genome-wide association studies)研究。共鉴定到位于4条染色体上,与耐盐性状关联的8个SNP位点。进一步在这些位点的连锁区段发现了 36个与植物刺激应答相关的基因。结合戴维逊氏棉转录组的基因表达数据,发现其中24个基因,如HB7、FMO1和NRT2.1等,受盐胁迫诱导差异表达。研究为深入开展棉花耐盐机理解析及耐逆材料创制提供了基因资源。