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水稻种子贮藏蛋白是稻米中仅次于淀粉的第二大类营养物质,一般认为稻米的蛋白质含量与其品质呈现负相关,因此,对稻米蛋白质含量的研究具有重要的理论意义和实践价值。本研究上篇以水稻腹白突变体wye1(whnte-belldosperm 1 )为研究材料,通过SDS-PAGE凝胶电泳分析发现该突变体腹部胚乳中的贮藏蛋白各个组分的含量发生改变,同时通过透射电镜观察发现突变体腹部胚乳细胞的内质网中滞留了大量蛋白聚集体,并且造粉体的发育也受到了明显的影响。另外通过定量RT-PCR分析发现突变体的胚乳中大多数内质网胁迫相关基因上调表达。因此,我们认为WBE1的突变导致了贮藏蛋白在内质网中聚集,进而产生了内质网胁迫,最终导致腹白的产生。主要研究结果如下:1.wbe 突变体主要表现为腹部一侧垩白大且稳定存在,蛋白质含量下降。SDS-PAGE凝胶电泳显示,与野生型相比,突变体腹部胚乳贮藏蛋白中的谷蛋白前体含量上升,成熟的酸性和碱性亚基含量下降;球蛋白和醇溶蛋白含量也降低。通过免疫印迹分析发现突变体中GluA、GluB、球蛋白以及醇溶蛋白中的Pro13a、Pro16k的含量都降低。透射电镜观察发现突变体胚乳细胞的内质网中有大量蛋白聚集体滞留,并且蛋白贮藏液泡(Protein Storage Vacuole,PSV)的蛋白充实程度明显较野生型低。2.通过对发育不同天数的突变体腹部的半薄切片观察发现近糊粉层细胞中造粉体发育出现异常,并且会出现大量单粒淀粉粒。说明WBE1能够影响腹部胚乳造粉体的发育。3.利用图位克隆的方法将WBE1基因定位在第3染色体短臂的158 kb区间内。基因预测发现该区域内包含17个开放阅读框(ORF)。通过测序比对发现突变体中的ORF13即LOC_Os03g24460基因在第四个外显子和第四内含子交界处有19bp的缺失,造成蛋白翻译的提前终止。转基因互补验证的结果证实了 LOC_Os03g24460即为目标基因。WBE1编码一个包含保守的转氨酶结构域的蛋白,可能参与支链氨基的合成或代谢。定量RT-PCR结果显示WBE1在根、茎、叶、叶鞘、穗以及发育不同时期的胚乳中都有表达。4.水稻原生质体亚细胞定位实验显示WBE1蛋白定位于内质网中。同时通过定量RT-PCR检测突变体发育胚乳中的内质网胁迫相关基因的表达发现突变体胚乳中发生了严重的内质网胁迫(ER Stress),并引起胚乳细胞发生程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)叶绿素是主要的光受体色素,叶绿体则是光合作用的主要场所。水稻中叶绿素合成、代谢或叶绿体发育受阻都会造成叶色变异,因此水稻叶色突变体是研究叶绿素生物合成以及叶绿体发育分子机制的理想材料。本研究下篇以水稻白条纹叶突变体wsl3(white-stripeleaf3)为研究材料,通过图位克隆方法获得了目标基因,并通过互补验证和干扰表达验证进一步证实了我们的结果。主要研究结果如下:1.水稻白条纹叶突变体wsl3在苗期的幼叶和抽穗期的剑叶及叶鞘中表现白条纹表型。利用图位克隆的方法将目标基因定位在第1染色体短臂的50.8 kb区间内。基因预测发现该区域内包含9个开放阅读框。通过测序比对发现,突变体中的ORF5即LOC_Os01g01920基因在第十五个外显子和第十五个内含子交界处缺失了 9个碱基,造成突变体的ws13蛋白缺失了 9个氨基酸。通过转基因互补验证和干扰表达验证进一步证实了我们的定位结果。WSL3编码一个包含HD结构域的蛋白,该家族蛋白可能具有磷酸水解酶活性,并参与核酸代谢和信号转导过程。2.透射电镜观察wsl3的叶绿体超微结构发现突变体的叶绿体呈现两种形态,其中一种的叶绿体内没有形成类囊体片层结构,而另一种虽有类囊体片层的形成,但较野生型的松散。另外对叶绿素合成相关基因的表达进行的定量RT-PCR分析结果表明,突变体中大部分的叶绿素合成相关基因的表达都下调。因此,WSL3的突变不仅影响了叶绿体的发育,同时也影响了叶绿素的合成,最终导致了白条纹叶的出现。