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本文在对各个反应体系优化的基础上,建立了黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1,AFM1）的两种酶免疫学检测方法,包括联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）和化学发光酶联免疫吸附分析法（Chemiluminescence immunoassay,CLEIA）并通过免疫亲和柱-高效液相色谱法进行方法学评估。此外,在AFM1单抗的基础上,通过细胞融合法探索制备抗黄曲霉毒素M1（AFM1）/抗辣根过氧化物酶（HRP）的双特异性抗体,以建立基于双特异性抗体的AFM1-ELISA提高AFM1检测方法的灵敏度。1.酶联免疫吸附分析法的建立采用碳二亚胺法将AFM1与载体蛋白BSA偶联,并将偶联产物通过紫外扫描鉴定AFM1与BSA特征吸收峰,成功制备了AFM1-BSA人工抗原;并通过优化ELISA反应体系,确定AFM1抗原包被浓度为0.5μg/mL,抗体工作浓度为1:30000,酶标二抗浓度为1:500,5%脱脂奶为标准品配制液,样品提取物为乙腈,液体乳稀释比为1:1,奶粉稀释比为1:5。建立了AFM1的一步法竞争性ELISA抑制曲线,IC50为0.27ng/mL,该方法的定量检测限为0.043ng/mL,在液态奶、酸酸乳中得到较好的回收率为86.46%120.12%,变异系数为1.42%6.42%。2.化学发光酶联免疫吸附分析法的建立通过对CLEIA反应体系的酶标二抗浓度、离子强度、pH、有机溶剂浓度等的全面优化,建立了AFM1的一步法化学发光酶联免疫分析方法,其IC50为0.08ng/mL,定量检测限可达0.024ng/mL,检测时间仅需30min。并在奶制品中进行不同水平的加标回收进行方法学评价,在液态奶中回收率为81.46%109.08%,变异系数为0.81%7.27%。3.免疫亲和柱-高效液相色谱法的建立及验证通过对AFM1免疫亲和柱上样缓冲液的优化,在国标参数条件下,建立了高效液相色谱AFM1的标准曲线,检测限与定量限分别为0.075ng/mL,0.3ng/mL;在液态奶中加标回收率为87.50%99.85%,变异系数为0.72%12.77%,在奶粉中为78.76%96.14%,变异系数为2.95%7.05%。同时还将建立的ELISA、CLEIA两种方法学与HPLC进行了相关性研究（相关性分别为R2=0.98869、R2=0.99704）,并应用上述三种方法对10份未知奶样品进行了AFM1的含量检测,ELISA、CLEIA检测结果与HPLC检测结果一致,表明建立的方法可用于实际样品中AFM1的快速筛查。4.抗黄曲霉毒素M1/抗辣根过氧化物酶双特异性抗体的制备利用8-氮鸟嘌呤（8-AG）诱导分泌抗AFM1抗体的杂交瘤细胞,获得次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷细胞系,通过电融合将AFM1缺陷型细胞与HRP免疫的小鼠脾细胞融合。利用间接ELISA与桥联ELISA作为筛选体系对三瘤细胞进行筛选。初筛后得到28株抗HRP的细胞株,经扩大培养获得1株抗AFM1/抗HRP的双阳性细胞株,由于克隆细胞的不稳定性最终克隆化丢失。