N15P多肽（序列：LGASWHRPDKCCLGY）是本课题组自主开发的一种CXCR4趋化因子受体的新型拮抗剂，已获得国家发明专利授权（授权号：CN1872879B）。炎症作为一种与人类多种疾病密切相关的病理现象，是当今医药学界的研究热点之一，但是目前治疗炎症药物大多数副作用较大。由于趋化因子及其受体与炎症过程密切相关，因此，本课题主要通过构建体内外的内毒素炎症模型，研究N15P肽对内毒素性炎症作用效应及机制。目的：拟通过构建体内外的内毒素（LPS）炎症模型，将N15P多肽作用于炎症模型，探讨N15P多肽对体内外内毒素（LPS）炎症模型的作用效应以及其作用机制，为将N15P多肽开发为新型的抗炎药物打下研究基础。方法：本课题的主要研究内容包括两大部分：（1）体外研究：内毒素（LPS）刺激外周血单核细胞（PBMC），构建内毒素炎症细胞模型，将不同浓度N15P多肽作用于该模型（对照药物：地塞米松）。运用ELISA及荧光实时定量PCR法，检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8蛋白以及mRNA含量的变化；经典的Griess试剂法，检测NO含量变化，探讨N15P多肽对内毒素炎症细胞模型产生的炎症细胞因子、NO的抑制作用。同时，运用western blot方法，检测炎症介质NF-kB蛋白含量的变化，以及荧光实时定量PCR法，检测炎症介质NF-kB、COX-2、TLR4、MyD88、PI3K、AKT mRNA含量的变化，从蛋白和mRNA水平探讨N15P多肽对内毒素炎症体外细胞模型的影响及作用机制。（2）体内研究：内毒素（LPS）腹腔注射入SPF级小鼠，构建内毒素炎症动物模型，将N15P多肽作用于该模型（对照药物：地塞米松）。LPS注射后16h，眼眶取血处死小鼠，取小鼠肝脏、肺部器官常规保存。运用血液分析仪进行测定小鼠的血液血常规（包括：白细胞总数、红细胞总数、血红蛋白、嗜中性粒细胞％、淋巴细胞％、红细胞压积、血小板等）；另外，进行血清分离，运用全自动生化分析仪，测定谷草转氨酶（GOT）、碱性磷酸酶（ALP）、谷丙转氨酶（GPT）的含量。ELISA法测定小鼠血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量变化；经典的Griess试剂法，检测血清中NO含量变化。常规制作小鼠肝脏、肺部病理切片，观察器官损伤程度；免疫组化染色观察NF－KB P65在肝脏细胞的表达情况；Western blot检测NF-kB在肝脏细胞含量的变化；RT-PCR反应检测肝脏组织中炎症因子及介质（NF-kB P65、COX-2、TLR4）的mRNA表达的变化。从器官病变程度、血液生化指标、炎症因子及介质蛋白和mRNA水平等方面探讨N15P多肽对内毒素炎症体内小鼠模型的影响及作用机制。结果：（一）体外研究部分内容：（1）终浓度为10μg/mL的LPS作用于PBMC24h，能有效刺激炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8的分泌。（2）ELISA检测法结果显示，与LPS组相比，中浓度组（5ng/ml）以及高浓度组（15ng/ml）的N15P多肽以及地塞米松均能有效抑制TNF-α、IL-6、IL-8蛋白表达（P﹤0.05）。（3）荧光定量PCR结果表明，与LPS组相比，N15P多肽以及地塞米松均能有效减少细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8mRNA的表达（P﹤0.05）。（4）NO检测试剂盒结果显示，N15肽用药组及地塞米松对照组的NO含量与LPS刺激组相比，有显著性减少（P﹤0.05）。（5）western blot以及荧光实时定量PCR结果显示，N15肽用药组以及地塞米松对照组均能有效减少细胞中NF-kB P65的蛋白含量以及mRNA的表达，与LPS刺激组相比，有显著性差异（P﹤0.05）。（6）荧光实时定量PCR结果表明，地塞米松用药对照组并无明显减少细胞中COX－2的mRNA的表达，与LPS刺激组相比，无显著性差异（P＞0.05）；但是，N15肽用药组却能有效抑制细胞中COX－2mRNA的表达，与LPS刺激组相比，有显著性差异（P﹤0.05）。可见，N15肽与地塞米松的作用机制存在差异。（7）荧光定量PCR结果表明，N15肽用药组及地塞米松用药对照组，均能有效抑制TLR4－MyD88以及PI3K－AKT这两大信息通路介质的mRNA表达，与LPS刺激组相比，有显著性差异（P﹤0.05）。表明N15肽能有效影响两大炎症信号通路(TLR4－MyD88以及PI3K－AKT)，从而达到抑制炎症发展进程的作用。(二)体内研究部分内容：（1）以LPS(20μg/kg)的剂量，对小鼠进行腹腔注射，能成功建立内毒素小鼠炎症模型。LPS感染组小鼠的肝脏和肺部均受到较为严重的损伤。（2）血常规以及生化指标检测显示，N15P肽及地塞米松均能有效抑制小鼠体内的炎症症状，且均能有效保护小鼠的肝脏，减少内毒素对其伤害。（3） ELISA结果显示，N15肽及地塞米松组均对小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8蛋白分泌有明显抑制作用。（4）N15肽及地塞米松组均对小鼠血清中NO分泌有明显抑制作用。（5）用HE染色切片半定量评定组织坏死程度，N15P肽用药组及地塞米松组的小鼠肝、肺组织的坏死程度，比LPS感染组均有明显的改善，说明N15P肽用药组及地塞米松组对小鼠肝脏、肺部起到了保护作用。（6）免疫组化结果显示，LPS感染组肝细胞中NF－KB P65呈强阳性表达，而N15P肽用药组和地塞米松组肝细胞中NF－KB P65呈弱阳性表达。（7）western blot结果显示，N15P肽用药组和地塞米松组肝细胞中NF－KB P65的表达均比LPS感染组有显著性减少（P﹤0.05）。说明N15P肽和地塞米松均能有效抑制NF－KB P65蛋白在肝组织中的表达。（8）RT-PCR结果表明，N15P肽用药组和地塞米松组肝细胞中NF－KB P65、TLR4的mRNA表达均比LPS感染组有明显减少（P﹤0.05）；N15P肽用药组COX-2mRNA比LPS感染组有明显减少（P﹤0.05），而地塞米松组COX-2mRNA与LPS感染组无显著性差异（P＞0.05）。结论： N15P多肽无论是对内毒素细胞炎症模型，还是对内毒素小鼠炎症模型，均有良好的抑制炎症因子（如：TNF-α、IL-6、IL-8、NO）及炎症介质（NF-kB、COX－2）蛋白及mRNA表达的能力，并且能有效抑制TLR4－MyD88及PI3K－AKT两大炎症信号通路的表达，并对小鼠肝脏及肺部具有保护作用，是一种具有开发前景的新型抗炎药物！