论文部分内容阅读
目的:1.研究VEGF-C是否调控肿瘤相关巨噬细胞的迁移。2.探究VEGF-C调控肿瘤相关巨噬细胞迁移的机制。3.研究VEGF-C介导的肿瘤巨噬细胞迁移是否促进NSCLC的转移。方法:1.实时定量基因扩增荧光检测系统(RT-qPCR)在正常人肺上皮细胞BEAS-2B以及各种肺癌细胞株(A549、H460、H358、H441、HCC827)中,提取细胞总RNA进行RT-qPCR,检测不同细胞株中VEGF-C mRNA水平表达差异。2.Transwell细胞迁移实验采用Transwell细胞迁移实验检测肿瘤条件培养基对巨噬细胞迁移的影响。3.蛋白免疫印迹(western blotting)在RAW264.7细胞株中,外加VEGF-C重组蛋白处理,用蛋白免疫印迹法检测其对巨噬细胞M2极化标志物CD206的表达的影响。另外,在A549细胞株中用通路抑制剂处理后,检测p-Src和p-p38的表达变化。4.ELISA法用ELISA试剂盒检测外加VEGF-C重组蛋白后,巨噬细胞M1、M2极化标志细胞因子IL12、IL23和IL10的表达。5.肿瘤转移实验将A549或过表达VEGF-C的A549细胞尾静脉注射入裸鼠体内,每只注射约5×10 ~6个细胞。其中给药组在注射肿瘤细胞5天后,灌胃SAR131675(100mg/Kg/天)。另外一组先在腹腔注射氯磷酸脂质体,再注射过表达VEGF-C的A549细胞。4周后对裸鼠进行脱颈处理,取其肝脏组织,观察肝脏转移灶数目。6.免疫组织化学法取肿瘤转移实验中的肝脏组织,进行免疫组织化学染色检测巨噬细胞标志物F4/80的表达情况。结果:1.在多种非小细胞肺癌细胞系中VEGF-C均有较高的表达;外加VEGF-C重组蛋白能够促进肿瘤相关巨噬细胞迁移,但不影响肿瘤相关巨噬细胞的极化。2.在A549和H441细胞株中,过表达VEGF-C能够显著增加巨噬细胞的迁移数目。VEGFR-2/3抑制剂能够明显逆转肿瘤细胞中VEGF-C过表达导致的巨噬细胞迁移。3.在RAW264.7细胞株中,使用VEGF-C重组蛋白能够激活Src/p38通路,VEGFR-2/3抑制剂处理能够明显抑制VEGF-C导致的Src/p38通路激活。同时,在使用Src/p38通路抑制剂后能够明显减少巨噬细胞的迁移数目。4.在A549细胞裸鼠转移瘤模型中,使用VEGFR-3抑制剂SAR131675后,肝脏组织肿瘤转移灶数目明显减少,并且组织中巨噬细胞浸润程度也降低。同时发现在过表达VEGF-C组中,其肝脏组织肿瘤转移灶数目明显增加,巨噬细胞浸润也增加。而在提前耗竭裸鼠体内巨噬细胞的实验组中,肿瘤转移灶数目以及巨噬细胞浸润程度均降低。结论:1.VEGF-C在NSCLC多种细胞株中高表达,并且能够促进肿瘤相关巨噬细胞的迁移。2.VEGF-C通过旁分泌作用于巨噬细胞上VEGFR-2/3从而激活Src/p38 MAPK信号,进而促进巨噬细胞的迁移。3.VEGF-C通过促进巨噬细胞的浸润,从而促进肿瘤的转移。